Die Gentherapie ist eine Utopie in der Medizin, die langsam Einzug in die Wirklichkeit hält. Immer mehr Gentherapeutika werden mit Erfolg in klinischen Studien geprüft und auch zugelassen, v. a. zur Therapie von monogenetischen Krankheiten sowie Krebserkrankungen. In der Mehrzahl kommen virale Vektoren zum Einsatz, aber auch nicht-virale Gentransfer-Systeme haben ihre Vorzüge und sind gefragt. Bei ihnen gilt es, Nachteile durch eine Immunogenität der verwendeten Nukleinsäure sowie eine geringe Transfektionseffizienz durch fehlendes „Targeting“, rasche systemische Clearance und insbesondere geringe Freisetzung aus den Endosomen zu überwinden. Mit der Lipid-Nanopartikel-Technologie steht heute ein effektiver nicht-viraler Vektor für spezielle klinische Anwendungen zur Verfügung. Einer breiteren Verwendung steht jedoch weiterhin das Fehlen eines effektiven, adaptierbaren „Targetings“ sowie ein sehr geringer „Endosomal Escape“ entgegen. In der vorliegenden Arbeit wurden zum einen zwei innovative Formen von Plasmid-DNA untersucht, Minicircle und Nanoplasmide, wobei sich Nanoplasmide aus praktischen Gründen als geeigneter für die therapeutische Verwendung erwiesen. Zum anderen wurde das Ziel verfolgt, ein spezifisches bidesmosidisches Triterpensaponin (AG1856) aus Agrostemma githago L. als Verstärker des „Endosomal Escape“ in lipidbasierte Gentransfer-Systeme - Lipoplexe und Lipid-Nanopartikel - zu integrieren. Zu diesem Zweck wurden erfolgreich Lipid-AG1856-Konjugate hergestellt, die sich jedoch hinsichtlich der gewünschten Freisetzung des Saponins unter schwach sauren Bedingungen unerwartet stabil zeigten. DSC-Messungen von Modell-Liposomen bestätigten eine Integration von AG1856 in DPPC-Liposomen nur, wenn diese auch Cholesterol enthielten. Lipid-AG1856-Konjugat war in DPPC/DOTAP-Membranen integrierbar, während AG1856 scheinbar nur adsorbiert wurde. Sowohl AG1856 als auch Lipid-AG1856-Konjugat störten die Formulierung von Lipoplexen und Lipid-Nanopartikeln und senkten deren Transfektionseffizienz z. T. erheblich. Bei Lipid-Nanopartikeln scheint die Adsorption des Saponins deren Endozytose zu blockieren. Nur reine DOTAP-Lipoplexe zeigten nach Zugabe von AG1856 verbesserte Partikelparameter und gesteigerte Transfektionseffizienz in vitro. Inwieweit die bloße Adsorption von AG1856 an DOTAP-Lipoplexe unter physiologischen Bedingungen erhalten bleibt, und ob sie schließlich ausreicht, um die Transfektionseffizienz zu steigern, ist es wert, eingehender untersucht zu werden. Eine Integration von Lipid-Saponin-Konjugat in Lipid-Nanopartikel funktioniert nicht. Ihre Lipid-Komposition ist bereits komplex und die Interaktion zwischen den Lipiden und dem ebenfalls amphiphilen Saponin stört die Partikelassemblierung. Sinnvoller erscheint für die Zukunft der Versuch, das Saponin durch Konjugation in hydrophile Gentransfer-Systeme zu integrieren, beispielsweise basierend auf Polylysin, PAMAM oder Chitosan.
Gene therapy is a utopia in medicine that is slowly becoming reality. More and more gene therapy drugs are being successfully tested in clinical trials and are also being approved, especially for the treatment of monogenetic diseases and cancer. Viral vectors are used in the majority of cases, but non-viral gene delivery systems also have their advantages and are in demand. Their disadvantages like immunogenicity of the nucleic acid used and low transfection efficiency due to lack of targeting, rapid systemic clearance and especially low release from the endosomes need to be overcome. With lipid nanoparticle technology, an effective non-viral vector is now available for specific clinical applications. However, the lack of an effective and adaptable "targeting" and a very low "endosomal escape" still stand in the way of a broader use. In the present work, two innovative forms of plasmid DNA were investigated, Minicircle and Nanoplasmids, whereby Nanoplasmids are more suitable for therapeutic use for practical reasons. Secondly, the aim was to integrate a specific bidesmosidic triterpene saponin (AG1856) from Agrostemma githago L. as an enhancer of "endosomal escape" into lipid-based gene delivery systems (lipoplexes and lipid nanoparticles). To this end, lipid-AG1856 conjugates were successfully prepared, but were unexpectedly stable with respect to the desired release of the saponin under weak acidic conditions. DSC measurements of model liposomes confirmed an integration of AG1856 in DPPC liposomes only if they also contained cholesterol. Lipid-AG1856 conjugate was integrable into DPPC/DOTAP membranes, whereas AG1856 appeared to be adsorbed only. Both AG1856 and lipid-AG1856 conjugate interfered with the formulation of lipoplexes and lipid nanoparticles and in some cases significantly reduced their transfection efficiency. In lipid nanoparticles, the adsorption of saponin seems to block their endocytosis. Only pure DOTAP lipoplexes showed improved particle parameters and increased transfection efficiency in vitro after addition of AG1856. The extent to which the mere adsorption of AG1856 to DOTAP lipoplexes is maintained under physiological conditions, and whether it is ultimately sufficient to enhance transfection efficiency, is worthy of further investigation. Integration of lipid-saponin conjugate into lipid nanoparticles does not work. Their lipid composition is already complex and the interaction between the lipids and the also amphiphilic saponin interferes with particle assembly. It seems more sensible for the future to try to integrate the saponin into hydrophilic gene transfer systems by conjugation, for example based on polylysine, PAMAM or chitosan.
