Lymphoid malignancies are a heterogeneous group of cancers that are responsible for one tenth of all cancer deaths in Europe. Immunotherapy using monoclonal antibodies has marked a major breakthrough in the therapy of lymphomas and leukemias since early 1990s, but cure is still difficult to achieve in a significant number of patients. As a next step, adoptive transfer of engineered T-cells has been shown to be a promising treatment. The current most common strategy of this form of cellular immunotherapy is targeting lineage-specific antigens, such as CD19, CD22 or BCMA for B-cell driven malignancies. These approaches still use antibody-fragments as recognition tools and are not truly tumor specific: Eliminating the entire cell lineage including normal, healthy B-cells can result in partial immunodeficiency. In addition, use of antibody-derivative chimeric receptors limits target repertoire to surface antigens, which frequently leads to relapse due to loss of target antigen expression on cell surface. T-cell receptors recognize peptides derived from both intracellular and surface proteins when presented on the cell surface embedded in an HLA allele, and this recognition can be sensitive enough to recognize cancer specific alterations such as single nucleotide changes or even posttranslational modifications. In this study, we aimed to develop T-cell receptors (TCRs) targeting cancer specific recurrent neo-antigens in lymphoma and leukemia for precision cellular immunotherapy. With this purpose, we generated mutation-specific T-cell lines by autologous priming from multiple healthy donors, targeting one of the most common driver mutations found in B-cell lymphomas; MyD88 L265P. This distinct point mutation substituting a proline for a lysine amino acid in the adaptor protein MyD88 can be found in around one fifth of all lymphoid malignancies, and associates with aggressive/hard-to-treat cases such as primary central nervous system lymphomas (PCNSL) and “activated B-cell type” diffuse large B-cell lymphoma (ABC-DLBCL), as it leads to constitutive signaling through activation of the transcription factor NF-kB providing growth and survival benefit for tumor cells. We generated several T-cell lines against the MyD88-L265P mutation, which were reactive selectively against the predicted mutant epitope in the context of HLA-B*07:02, but not against the corresponding wild-type peptide expressed in normal B-cells. T-cell receptor sequences from these lines were cloned into the retroviral vector pMP71 and expressed on T-cells of healthy donors for further characterization. All cloned TCRs showed mutation-specific and HLA-B7 restricted reactivity with varying functional avidity. TCR-engineered T-cells (TCR-T cells) were able to selectively recognize and kill engineered target cells expressing MyD88 L265P, indicating that the mutant epitope is naturally processed and presented on HLA-B*07:02. In order to further evaluate the therapeutic potency, we tested TCR-T cells against non-Hodgkin lymphoma cell lines naturally harboring MyD88 L265P mutation, and again observed HLA-restricted and mutation-specific reactivity, as well as cytotoxic activity accompanied by antigen induced proliferation of TCR-T cells. Following these encouraging results in vitro, we developed two xenograft mouse models using human non-Hodgkin lymphoma cell lines growing in mice to assess therapeutic efficacy of adoptively transferred TCR-T cells in vivo. Treatment with a single dose of TCR-T cell injection led to durable regression of established tumors. Two models of immunodeficient mice were used. NOG mice (NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull) are derived by a further modification of Non-Obese-Diabetic (NOD) mice crossed with SCID (severe combined immunodeficiency) mice, by further introducing a defect in the gamma-chain of the Interleukin-2 receptor: they are routinely used for xenogenic tumor experiment, being unable to spontaneously reject grafted human cells. As a second model, NOG-mice genetically modified to express human Interleukin-2 were used: by endogenously producing human Interleukin-2 they provide better support for adoptively transferred T cells. Differences in treatment response between conventional NOG and human interleukin-2 expressing NOG mice used in our in vivo studies revealed important indications for T-cell persistence and exhaustion. Finally, initial safety screens to predict possible cross-reactivity or allo-reactivity did not show any sign of off-target reactivity by the mutation-specific TCR. Taken together, our data suggest that mutation-specific TCRs can be used to target the MyD88 L265P mutation, and hold promise for precision therapy in a significant subgroup of B-cell malignancies.
Lymphoide Malignome sind eine heterogene Gruppe von Krebserkrankungen, die für ein Zehntel aller Krebstodesfälle in Europa verantwortlich sind. Die Immuntherapie mit monoklonalen Antikörpern hat seit Anfang der 1990er Jahre einen Durchbruch in der Behandlung von Lymphomen und Leukämien gebracht, doch ist es nach wie vor schwierig, einen erheblichen Teil der Patienten dauerhaft zu heilen. Als nächster Schritt in der Entwicklung der Immuntherapie hat sich der adoptive Transfer von genetisch manipulierten T-Zellen als vielversprechende Behandlung angedeutet. Die derzeit gängigste Strategie dieser Form der zellulären Immuntherapie ist gerichtet gegen linienspezifische Antigene der B-zell Reihe wie CD19, CD22 oder BCMA. Diese Ansätze verwenden immer noch Antikörperfragmente als spezifische Erkennungsinstrumente und sind daher nicht wirklich tumorspezifisch: Die Eliminierung des gesamten Pools an Zellen, welche das Zielantigen tragen, einschließlich der normalen, gesunden B-Zellen, kann durchaus zu einer Immundefizienz mit Antikörpermangel führen. Darüber hinaus wird durch die Verwendung von chimären Antikörperrezeptoren das Zielrepertoire auf Oberflächenantigene beschränkt, was aufgrund des Verlusts der Expression von Zielantigenen auf der Zelloberfläche häufig zu Rückfällen führt. Die meisten krebsinduzierenden Mutationen entstehen jedoch in intrazellulären Proteinen. Peptide, die von intrazellulären Proteinen stammen, werden erkannt, wenn sie auf der Zelloberfläche in einem HLA-Klasse-I-Molekül eingebettet den T-Zellen „präsentiert“ werden. In dieser Arbeit haben wir T-Zell-Rezeptoren (TCRs) entwickelt, die auf krebsspezifische, wiederkehrende Neo-Antigene in Lymphomen und Leukämien abzielen und eine echte tumorspezifische, hochpräzise zelluläre Immuntherapie ermöglichen. Zu diesem Zweck haben wir durch autologes Priming von mehreren gesunden Spendern mutationsspezifische T-Zelllinien erzeugt, die auf eine der häufigsten Treibermutationen bei B-Zell-Lymphomen abzielen: MyD88 L265P. Diese Punktmutation, bei der eine Leucin- durch eine Prolin-Aminosäure im Adaptorprotein MyD88 ersetzt wird, kommt bei etwa einem Fünftel aller lymphatischen Neoplasien vor und ist mit einem aggressiven/schwer zu behandelnden Verlauf assoziiert, wie z. B. bei primären Lymphomen des zentralen Nervensystems (PCNSL) und bei diffus- großzelligen B-Zell- Lymphomen vom "aktivierten B-Zell-Typ" (ABC-DLBCL). Wir haben mehrere T-Zelllinien gegen die MyD88-L265P-Mutation entwickelt. Diese TZell- Linien waren demnach selektiv gegen das vorhergesagte L265P Mutationsepitop im Kontext von HLA-B*07:02 reaktiv, nicht aber gegen das entsprechende Wildtyp-Peptid, das in normalen B-Zellen exprimiert wird oder wenn das HLA-A-B*07:02 Molekül fehlt. TZell- Rezeptor-Sequenzen aus diesen Linien wurden in den retroviralen Vektor pMP71 kloniert und zur weiteren Charakterisierung auf T-Zellen gesunder Spender exprimiert. Alle klonierten TCRs zeigten eine mutationsspezifische und auf HLA-B7 beschränkte Reaktivität mit unterschiedlicher funktioneller Avidität. TCR-entwickelte T-Zellen (TCR-TZellen) waren in der Lage, MyD88 L265P exprimierende Zielzellen selektiv zu erkennen und zu killen als Beweis, dass das mutierte Epitop auf natürliche Weise prozessiert und auf HLA-B*07:02 präsentiert wird. Um die therapeutische Wirksamkeit solcher T-Zellen weiter zu untersuchen, haben wir TCR-T-Zellen gegen Non-Hodgkin-Lymphom-Zelllinien getestet, die auf natürliche Weise die MyD88 L265P-Mutation tragen, Erneut konnten wir eine HLA-gebundene und mutationsspezifische Reaktivität und zytotoxische Aktivität nachweisen, begleitet von einer antigeninduzierten Proliferation der genmodifizierten TCR-T-Zellen. Nach diesen ermutigenden Ergebnissen in vitro entwickelten wir zwei Xenograft-Mausmodelle mit in Mäusen wachsenden humanen Non-Hodgkin-Lymphom- Zelllinien, um die therapeutische Wirksamkeit von adoptiv transferierten TCR-T-Zellen in vivo zu beweisen. Die Behandlung mit einer einmaligen Injektion von TCR-T-Zellen führte zu einer dauerhaften Rückbildung der zuvor etablierten Tumore. Es wurden zwei Modelle von Immun defizienten Mäusen verwendet. NOG-Mäuse (NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull) werden durch eine weitere Modifikation von „nicht-obesen diabetischen“ (NOD) Mäusen, die mit SCID-Mäusen (schwere kombinierte Immundefizienz) gekreuzt wurden, gewonnen, indem ein weiterer Defekt in der Gamma-Kette des Interleukin-2-Rezeptors eingeführt wird: Diese Zellen werden routinemäßig für xenotransplantierte Tumorexperimente verwendet, da sie nicht in der Lage sind, menschliche Zellen spontan abzustoßen. Als zweites Modell wurden NOG-Mäuse verwendet, die genetisch so verändert wurden, dass sie menschliches Interleukin-2 exprimieren: die endogene IL-2 Produktion bietet eine effektivere Unterstützung für adoptiv-transferierte T-Zellen. Unterschiede im Ansprechen auf die Behandlung zwischen herkömmlichen NOGMäusen und humanes Interleukin-2 exprimierenden NOG-Mäusen, die in unseren Invivo- Experimenten verwendet wurden, ergaben wichtige Hinweise auf mögliche Mechanismen der Persistenz bzw. der Erschöpfung transferierter T-Zellen. Schließlich ergaben erste Sicherheitstests zur Vorhersage einer möglichen Kreuzreaktivität oder Allo-Reaktivität keine Anzeichen für eine „Off-Target“-Reaktivität des mutationsspezifischen TCR. Insgesamt deuten unsere Daten darauf hin, dass mutationsspezifische TCRs zur Bekämpfung der MyD88-L265P-Mutation eingesetzt werden können und vielversprechend für eine echte tumorspezifische, zielgerichtete Therapie bei einer großen Untergruppe von B-Zell-Malignomen sind.
