dc.contributor.author
Cheng, Xi
dc.date.accessioned
2018-06-07T17:34:17Z
dc.date.available
2010-09-23T12:53:45.101Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/4001
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-8201
dc.description.abstract
Promoters comprise one of most the important classes of eukaryotic
transcriptional regulatory elements. Identification and characterization of
these elements is vital to the understanding of complex gene regulation
networks. Intensive efforts have been undertaken in developing approaches to
identify the promoters on a genome-wide scale. However, functional studies,
which are mostly performed by using reporter gene assay on a gene-by-gene
basis, have become a limitation for genome-wide promoter characterizations. In
this study, transfected-cell array (TCA) technology was applied as a high-
throughput method for functional evaluation of 255 human promoters for genes
from human chromosome 21 (Chr21) and genes involved in inflammatory bowel
disease. The TCA technique offers a robust platform for high-throughput
functional studies of genes and proteins in the context of living cells. The
TCA technique is a combination of microarray technology with cellular biology
methods such as transfection and cell culture. The transfection method used in
TCA is named reverse transfection because the order of addition of
transfection probes and cells in TCA experiment has been reversed compared
with conventional transfection. On cell arrays, large sets of nucleic acid
samples are spotted and temporarily immobilized on glass slides. After
spotting, adherent cells are added to arrays and thus a monolayer is created
on the surface of the slides. Only cells growing on top of the nucleic acid
spots became transfected, resulting in localized transfected cell clusters
within a lawn of non-transfected cells. Combined with appropriate detection
assays, the phenotypic effects of thousands of cell clusters can be monitored
in parallel. In the present study, two hundred and fifty-five promoters were
examined by reverse transfection on cell arrays. Promoter fragments with
length of 2500 bp were amplified and cloned into a promoter-less vector
upstream of a fluorescence reporter gene. For high-throughput functional
analysis, the promoter-reporter constructs were introduced into a human
embryonic kidney cell line (HEK293T) on transfected cell array. As a result,
seventy-one (27.8%) promoters were found to be active in HEK293T cells; in
contrast, 184 promoters did not showed transcription activity. High
correlations were observed between promoter activities and endogenous
transcript levels as well as ubiquitous tissue expression. Over half of the
active promoter fragments were found to associate with RNA polymerase IIa (Pol
IIa) binding site. Enrichment of CpG islands and downstream promoter elements
(DPE) were observed for active promoters. Among 184 promoters which showed no
activity in TCA assay, eighty-five promoters could be activated by treatment
of cells with addition of external stimuli such as PMA, Trichostatin A and
arsenite or depletion of serum from the standard growth medium. Therefore, in
total 61.2% (156/255) of the cloned promoter fragments could drive reporter
gene expression under at least one of the tested circumstances. The
corresponding genes of 99 promoters that remained silent in any treatment
condition showed less endogenous expression in HEK293T cells and restricted
tissue expression. In addition to the 2500 bp fragments, truncated fragments
with length of 500 bp were designed and cloned for a subset of 62 promoters.
The promoter activities of shorter fragments were determined and compared with
their longer counterparts. The truncation resulted in not only the change of
promoter activity, but also different responses to external stimuli,
supporting the presence of regulatory elements within distal promoter regions.
An enrichment of binding sites for transcription factors that can integrate
signals from the administered stimuli into gene expression were found in these
regions. The identified promoter response patterns represent a valuable
resource for the elucidation of the complex mechanisms governing
transcriptional regulation on the level of the promoters on a whole-chromosome
scale. Taken together, the study presented here provides further insights into
the diversity of mammalian promoter functions. The experimental data of
promoter activities acquired in this study may be helpful in understanding the
regulation of gene expression. Moreover, the successful application of TCA in
this study demonstrates that the combination of TCA technique with gene
expression profiling and bioinformatics tools represents a robust and cost-
effective platform for genome-wide functional studies of regulatory sequences.
de
dc.description.abstract
Promotoren stellen eine der wichtigsten Klassen der eukaryotischen,
transkriptionellen Regulationselemente dar. Die Identifikation und
Charakterisierung dieser Elemente ist von besonderer Bedeutung für das
Verständnis komplexer Genregulationsnetzwerke. Bisher gab es intensive
Bemühungen, die Transkritionsstartstelle (TSS) und Promotoren genomweit zu
erfassen. Jedoch gab es bei funktionalen Studien Grenzen in Bezug auf eine
genomweite Charakterisierung der Promotoren, da sie meist durchgeführt werden,
indem Reportergenkonstrukte auf einer Gen-für-Gen-Basis benutzt wurden. In
dieser Arbeit wurden transfizierte Zellarrays (Transfected-Cell-Array, TCA)
als Hochdurchsatzverfahren für die Evaluation der 255 Promotoren der Gene des
menschlichen Chromosoms 21 (Chr21) und von Genen, die mit chronisch-
entzündlichen Darmerkrankungen (Inflammatory Bowel Desease, IBD)
zusammenhängen, verwendet. TCA bietet eine solide Grundlage für Hochdurchsatz-
Funktionsstudien von Genen und Proteinen bei lebenden Zellen. TCA ist eine
Technik, die die Microarray-Techniken mit Methoden der Zellbiologie wie
Transfektion und Zellkulturen verbindet. Die Transfektionsmethode, die bei TCA
zur Anwendung kommt, wird auch „Reverse Transfektion“ genannt, da
Transfektionsproben und Zellen im TCA Experiment in umgekehrter Reihenfolge
zusammengefügt werden, im Vergleich zu traditionellen Transfektionen. Auf dem
Zellarray werden große Mengen von Nukleinsäureproben auf einem Objektträger
aufgebracht, danach werden die adhärent wachsenden Zellen dem Array
hinzugefügt. Dadurch wird eine Monozelluläreschicht auf der Oberfläche des
Objektträgers erzeugt. Nur Zellen, die oben auf den Nukleinsäurespots wachsen,
werden transfiziert. Dadurch entstehen lokal transfizierte Zellcluster in
einem Zellrasen von nicht-transfizierten Zellen. Verbunden mit angemessenen
Detektionsproben, können so die phänotypischen Effekte bei Tausenden
Zellcluster parallel beobachtet werden. In der vorliegenden Untersuchung
wurden auf dem Zellarray 255 Promotoren mittels reverser Transfektion
untersucht. Fragmente von Promotoren in der Länge von 2500 bp wurden
vervielfältigt und strangaufwärts eines fluoreszierenden Reportergens in einen
promotorenlosen Vektor kloniert. Für eine Hochdurchsatz-Funktionsanalyse
wurden die Promotorreporter-Konstrukte in eine menschliche, embryonale
Nierenzellenlinie (HEK 293T) auf einem transfizierten Zellenarray untersucht.
Als Ergebnis erschienen 71 (27,8%) der Promotoren in HEK293T aktiv. Im
Gegensatz hierzu zeigten 184 Promotoren keine Transkriptionsaktivität. Hier
wurden hohe Korrelationen zwischen Promotorenaktivität und endogenen
Transkriptionslevels sowie ubiquitäre Expression im Gewebe beobachtet. Über
die Hälfte der aktiven Promotorenfragmente wurden dabei beobachtet wie sie an
der RNA Polymerase IIa (Pol IIa) Bindestelle andockten. Unter den 184
Promotoren, die keine Aktivität im TCA-Test zeigten, konnten 85 Promotoren
durch die Behandlung der Zellen mit zusätzlichen äußeren Stimuli wie PMA,
Trichostatin A und arseniger Säure oder ein abgereichertes Serum aus
gewöhnlichem Wachstumsmedium aktiviert werden. Aus diesem Grund konnten unter
wenigstens einem der getesteten Umstände bei 61,2% (156/255) der klonierten
Promotorenfragmente Reportergen-Expression induziert werden. Die restlichen 99
Promotoren, die unter allen getesteten Umständen inaktiv blieben, zeigten
weniger endogene Expression in HEK293T-Zellen und beschränkte Gewebe-
Expression. Zusätzlich zu den Fragmenten mit 2500 bp Länge wurden für ein
Subset von 62 Promotoren kürzere Fragmente der Länge von 500 bp hergestellt
und kloniert. Die Promotorenaktivität der kürzeren Fragmente wurde bestimmt
und mit der der längeren Fragmente verglichen. Das Ergebnis war nicht nur ein
Wechsel in der Promotorenaktivität, sondern auch veränderte Reaktionen auf die
externen Stimuli. Beides legt die Präsenz von Steuerungselementen in den
distalen Promoterabschnitten nahe. In diesen Abschnitten fand sich eine
Anreicherung von Bindestellen für Transkriptionsfaktoren, die Signale von den
verabreichten Stimuli in die Genexpression integrieren konnten. Die
identifizierten Promotorenreaktionen bieten eine wertvolle Quelle für die
Aufklärung der komplexen Mechanismen, die die Transkriptionssteuerung auf der
Ebene der Promotoren bei ganzen Chromosomen bestimmen. Zusammenfassend kann
festgehalten werden, dass diese Untersuchungen weitere Einblicke in die
Komplexität der Promotorenfunktionen von Säugetieren gegeben hat. Die hier
erhobenen Daten der Experimente können dazu beitragen, die Regulation der
Genexpression besser zu verstehen. Darüber hinaus kann die erfolgreiche
Anwendung von TCA in diesen Untersuchungen zeigen, dass die Kombination von
TCA-Techniken mit Profilierung von Genexpression und Bioinformatik-Werkzeugen
eine solide Basis für eine kostengünstige, genomweite Funktionsanalyse von
Regulationssequenzen bietet.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Transfected cell array
dc.subject
High-throughput
dc.subject
Functional analysis
dc.subject
Human gene promoters
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
High-throughput functional analysis of human gene promoters using transfected
cell arrays
dc.contributor.firstReferee
Prof.Dr. Hans Lehrach
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Gerd Multhaup
dc.date.accepted
2010-09-07
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000019143-3
dc.title.translated
Hochdurchsatz-Funktionsanalyse menschlicher Gen-Promotoren mit Hilfe von
transfizierten Zellarrays
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000019143
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000008321
dcterms.accessRights.dnb
free
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open access