Promoters comprise one of most the important classes of eukaryotic transcriptional regulatory elements. Identification and characterization of these elements is vital to the understanding of complex gene regulation networks. Intensive efforts have been undertaken in developing approaches to identify the promoters on a genome-wide scale. However, functional studies, which are mostly performed by using reporter gene assay on a gene-by-gene basis, have become a limitation for genome-wide promoter characterizations. In this study, transfected-cell array (TCA) technology was applied as a high- throughput method for functional evaluation of 255 human promoters for genes from human chromosome 21 (Chr21) and genes involved in inflammatory bowel disease. The TCA technique offers a robust platform for high-throughput functional studies of genes and proteins in the context of living cells. The TCA technique is a combination of microarray technology with cellular biology methods such as transfection and cell culture. The transfection method used in TCA is named reverse transfection because the order of addition of transfection probes and cells in TCA experiment has been reversed compared with conventional transfection. On cell arrays, large sets of nucleic acid samples are spotted and temporarily immobilized on glass slides. After spotting, adherent cells are added to arrays and thus a monolayer is created on the surface of the slides. Only cells growing on top of the nucleic acid spots became transfected, resulting in localized transfected cell clusters within a lawn of non-transfected cells. Combined with appropriate detection assays, the phenotypic effects of thousands of cell clusters can be monitored in parallel. In the present study, two hundred and fifty-five promoters were examined by reverse transfection on cell arrays. Promoter fragments with length of 2500 bp were amplified and cloned into a promoter-less vector upstream of a fluorescence reporter gene. For high-throughput functional analysis, the promoter-reporter constructs were introduced into a human embryonic kidney cell line (HEK293T) on transfected cell array. As a result, seventy-one (27.8%) promoters were found to be active in HEK293T cells; in contrast, 184 promoters did not showed transcription activity. High correlations were observed between promoter activities and endogenous transcript levels as well as ubiquitous tissue expression. Over half of the active promoter fragments were found to associate with RNA polymerase IIa (Pol IIa) binding site. Enrichment of CpG islands and downstream promoter elements (DPE) were observed for active promoters. Among 184 promoters which showed no activity in TCA assay, eighty-five promoters could be activated by treatment of cells with addition of external stimuli such as PMA, Trichostatin A and arsenite or depletion of serum from the standard growth medium. Therefore, in total 61.2% (156/255) of the cloned promoter fragments could drive reporter gene expression under at least one of the tested circumstances. The corresponding genes of 99 promoters that remained silent in any treatment condition showed less endogenous expression in HEK293T cells and restricted tissue expression. In addition to the 2500 bp fragments, truncated fragments with length of 500 bp were designed and cloned for a subset of 62 promoters. The promoter activities of shorter fragments were determined and compared with their longer counterparts. The truncation resulted in not only the change of promoter activity, but also different responses to external stimuli, supporting the presence of regulatory elements within distal promoter regions. An enrichment of binding sites for transcription factors that can integrate signals from the administered stimuli into gene expression were found in these regions. The identified promoter response patterns represent a valuable resource for the elucidation of the complex mechanisms governing transcriptional regulation on the level of the promoters on a whole-chromosome scale. Taken together, the study presented here provides further insights into the diversity of mammalian promoter functions. The experimental data of promoter activities acquired in this study may be helpful in understanding the regulation of gene expression. Moreover, the successful application of TCA in this study demonstrates that the combination of TCA technique with gene expression profiling and bioinformatics tools represents a robust and cost- effective platform for genome-wide functional studies of regulatory sequences.
Promotoren stellen eine der wichtigsten Klassen der eukaryotischen, transkriptionellen Regulationselemente dar. Die Identifikation und Charakterisierung dieser Elemente ist von besonderer Bedeutung für das Verständnis komplexer Genregulationsnetzwerke. Bisher gab es intensive Bemühungen, die Transkritionsstartstelle (TSS) und Promotoren genomweit zu erfassen. Jedoch gab es bei funktionalen Studien Grenzen in Bezug auf eine genomweite Charakterisierung der Promotoren, da sie meist durchgeführt werden, indem Reportergenkonstrukte auf einer Gen-für-Gen-Basis benutzt wurden. In dieser Arbeit wurden transfizierte Zellarrays (Transfected-Cell-Array, TCA) als Hochdurchsatzverfahren für die Evaluation der 255 Promotoren der Gene des menschlichen Chromosoms 21 (Chr21) und von Genen, die mit chronisch- entzündlichen Darmerkrankungen (Inflammatory Bowel Desease, IBD) zusammenhängen, verwendet. TCA bietet eine solide Grundlage für Hochdurchsatz- Funktionsstudien von Genen und Proteinen bei lebenden Zellen. TCA ist eine Technik, die die Microarray-Techniken mit Methoden der Zellbiologie wie Transfektion und Zellkulturen verbindet. Die Transfektionsmethode, die bei TCA zur Anwendung kommt, wird auch „Reverse Transfektion“ genannt, da Transfektionsproben und Zellen im TCA Experiment in umgekehrter Reihenfolge zusammengefügt werden, im Vergleich zu traditionellen Transfektionen. Auf dem Zellarray werden große Mengen von Nukleinsäureproben auf einem Objektträger aufgebracht, danach werden die adhärent wachsenden Zellen dem Array hinzugefügt. Dadurch wird eine Monozelluläreschicht auf der Oberfläche des Objektträgers erzeugt. Nur Zellen, die oben auf den Nukleinsäurespots wachsen, werden transfiziert. Dadurch entstehen lokal transfizierte Zellcluster in einem Zellrasen von nicht-transfizierten Zellen. Verbunden mit angemessenen Detektionsproben, können so die phänotypischen Effekte bei Tausenden Zellcluster parallel beobachtet werden. In der vorliegenden Untersuchung wurden auf dem Zellarray 255 Promotoren mittels reverser Transfektion untersucht. Fragmente von Promotoren in der Länge von 2500 bp wurden vervielfältigt und strangaufwärts eines fluoreszierenden Reportergens in einen promotorenlosen Vektor kloniert. Für eine Hochdurchsatz-Funktionsanalyse wurden die Promotorreporter-Konstrukte in eine menschliche, embryonale Nierenzellenlinie (HEK 293T) auf einem transfizierten Zellenarray untersucht. Als Ergebnis erschienen 71 (27,8%) der Promotoren in HEK293T aktiv. Im Gegensatz hierzu zeigten 184 Promotoren keine Transkriptionsaktivität. Hier wurden hohe Korrelationen zwischen Promotorenaktivität und endogenen Transkriptionslevels sowie ubiquitäre Expression im Gewebe beobachtet. Über die Hälfte der aktiven Promotorenfragmente wurden dabei beobachtet wie sie an der RNA Polymerase IIa (Pol IIa) Bindestelle andockten. Unter den 184 Promotoren, die keine Aktivität im TCA-Test zeigten, konnten 85 Promotoren durch die Behandlung der Zellen mit zusätzlichen äußeren Stimuli wie PMA, Trichostatin A und arseniger Säure oder ein abgereichertes Serum aus gewöhnlichem Wachstumsmedium aktiviert werden. Aus diesem Grund konnten unter wenigstens einem der getesteten Umstände bei 61,2% (156/255) der klonierten Promotorenfragmente Reportergen-Expression induziert werden. Die restlichen 99 Promotoren, die unter allen getesteten Umständen inaktiv blieben, zeigten weniger endogene Expression in HEK293T-Zellen und beschränkte Gewebe- Expression. Zusätzlich zu den Fragmenten mit 2500 bp Länge wurden für ein Subset von 62 Promotoren kürzere Fragmente der Länge von 500 bp hergestellt und kloniert. Die Promotorenaktivität der kürzeren Fragmente wurde bestimmt und mit der der längeren Fragmente verglichen. Das Ergebnis war nicht nur ein Wechsel in der Promotorenaktivität, sondern auch veränderte Reaktionen auf die externen Stimuli. Beides legt die Präsenz von Steuerungselementen in den distalen Promoterabschnitten nahe. In diesen Abschnitten fand sich eine Anreicherung von Bindestellen für Transkriptionsfaktoren, die Signale von den verabreichten Stimuli in die Genexpression integrieren konnten. Die identifizierten Promotorenreaktionen bieten eine wertvolle Quelle für die Aufklärung der komplexen Mechanismen, die die Transkriptionssteuerung auf der Ebene der Promotoren bei ganzen Chromosomen bestimmen. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass diese Untersuchungen weitere Einblicke in die Komplexität der Promotorenfunktionen von Säugetieren gegeben hat. Die hier erhobenen Daten der Experimente können dazu beitragen, die Regulation der Genexpression besser zu verstehen. Darüber hinaus kann die erfolgreiche Anwendung von TCA in diesen Untersuchungen zeigen, dass die Kombination von TCA-Techniken mit Profilierung von Genexpression und Bioinformatik-Werkzeugen eine solide Basis für eine kostengünstige, genomweite Funktionsanalyse von Regulationssequenzen bietet.
