Alle lebenden Organismen verfügen über ein Netzwerk von Proteinen, das eine effiziente Erkennung und Reparatur von DNA-Schäden gewährleistet. Mutationen in den zugrunde liegenden Genen sind mit schwerwiegenden Krankheiten des Menschen verknüpft. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersuchten genetisch bedingten Krankheiten Nijmegen Breakage Syndrom (NBS) und NHEJ1/XLF- Defizienz gehen auf Defekte in der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen zurück. Über 90% der NBS-Patienten sind homozygote Träger der Gründermutation 657del5 im NBN-Gen, die zur Expression eines varianten Genproduktes, p70-Nibrin, führt. Das von uns generierte NBS-Mausmodell erlaubte erstmals in vivo Untersuchungen in Abwesenheit von Nibrin und ermöglichte uns den Nachweis einer Restfunktion von p70-Nibrin, die bislang nur vermutet wurde. Zwei wichtige Befunde unserer Untersuchungen sind im Zusammenhang mit dem erhöhten Tumorrisiko von NBS-Patienten und auch von heterozygoten Trägern einer NBN- Mutation zu sehen: Die p70-Nibrinmenge in Zelllinien (LCLs), die von NBS- Patienten angelegt wurden, steht in signifikantem Zusammenhang mit der Inzidenz von Lymphomen. Eine umfassende Proteomstudie, wiederum an unserem NBS-Mausmodell, zeigte eine überdurchschnittliche häufige Veränderung der Expression von Proteinen mit Funktion in der Redoxhomöostase in Abwesenheit von Nibrin als Reaktion auf ionisierende Bestrahlung. Entsprechende Untersuchungen an bestrahlten Zellkulturzellen bestätigten erhöhte Mengen von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) als Folge fehlenden Nibrins. Auf die mögliche klinische Relevanz dieses Befundes bezüglich einer besseren Kontrolle des ROS-Levels bei Patienten wird hingewiesen. Eine Mutationsanalyse an Proben von insgesamt 121 Patienten mit NBS-ähnlichem Phänotyp führte zur Identifizierung von vier bislang nicht beschriebenen Mutationen im NHEJ1-Gen. Von zwei compound heterozygote Brüdern mit NHEJ1/XLF-Defizienz zeigte einer einen schweren Krankheitsverlauf, während der andere klinisch nahezu unauffällig war. In ersten Untersuchungen zur NHEJ1-Expression in Patientenzellen konnten keine Hinweise auf die Ursache dieser, für die NHEJ1 /XLF-Defizienz erstmals beschriebene klinische Heterogenität, die hier sogar intrafamiliär vorliegt, gefunden werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde das hSNM1B/Apollo-Gen, basierend auf seiner strukturellen Ähnlichkeit mit dem PSO2-Gen der Hefe (S. cerevisiae), identifiziert und nachfolgend in seiner Funktion charakterisiert. Mutationen in diesem Gen sind bislang nicht mit einer Krankheit beim Menschen verknüpft. Eine umfassende Analyse des Phänotyps verschiedener Zelllinien nach hSNM1B/Apollo-Depletion (siRNA), zusammen mit der Identifizierung von TRF2 und den HSP70-Proteinen als direkte hSNM1B/Apollo-Interaktoren, resultierte in der Etablierung von hSNM1B/Apollo als Molekül der frühen Antwort auf DNA-Schäden. hSNM1B/Apollo stimuliert die Autophosphorylierung und Aktivierung des zentralen Moleküls der zellulären Reaktionen auf DNA-Doppelstrangbrüche, ATM, und möglicherweise des entsprechenden Aktivators der zellulären Antwort auf eine Blockierung der Replikation durch DNA-Schäden, ATR.
All living organisms possess a network of proteins which allows efficient recognition and repair of DNA damage. Mutations in underlying genes are associated with severe diseases in humans. The diseases investigated in this work, Nijmegen breakage syndrome and NHEJ1/XLF-Deficiency, are based on defects in the repair of DNA double-strand breaks (DSBs). Another protein investigated here, human SNM1B/Apollo, is not associated with a human disease yet. Apollo is one of at least three human proteins with sequence similarity to the yeast (S. cerevisiae) crosslink repair protein, PSO2(SNM1). We have previously shown that Apollo is involved in the cellular response to treatment with DNA interstrand crosslink inducing mutagens, such as Mitomycin C or Cisplatin, and to ionizing radiation. Recent reports, however, have described hSNM1B as a telomeric accessory factor implicated in the protection of telomeres from DNA repair and/or in their replication and indeed we and others have found hSNM1B to interact physically, and to colocalize, with TRF2, a core protein of the telomere shelterin complex. Our data implicate hSNM1B/Apollo in the early cellular response to DSBs. hSNM1B accumulates at damaged DNA as shown by immunofluorescence studies and live-cell imaging experiments. Furthermore siRNA mediated knockdown of hSNM1B results in attenuated ATM autophosphorylation with the so far analysed ATM substrates being also affected. These observations suggest an important role for hSNM1B in the response to IR damage, a role that may be, in part, upstream of the central player in the maintenance of genome integrity, ATM.
