Allergic contact dermatitis (ACD) is a T cell-mediated disease. Approximately 20% of the population in industrialised countries is affected by at least one contact allergy1. However, due to technical limitations, in vitro T cell activation has only been described for a few contact allergens so far. Within the scope of this thesis, an activation-induced marker (AIM) assay in combination with flow cytometry was established to detect T cell activation following stimulation with chemical allergens. The metal salts NiSO4, CoCl2 and PdCl2 and the organic model allergen 2,4,6‑trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) were selected as chemical allergens. mRNA of T cell receptors (TCR) involved in the activation were sequenced via high-throughput sequencing (HTS), and TCR repertoires were analysed. The AIM T cell assay enables the fast, sensitive, quantitative, and comprehensive analysis of allergen‑specific, naïve and memory CD154+CD4+ or CD137+CD8+ T cells, respectively. The assay setup allows cell sorting for downstream experiments. In parallel, other associated surface and intracellular markers and expressed cytokines can be examined. In the AIM T cell assay, high chemical concentrations are tolerated, which capture the complete reactive T cell pool. In addition, no prior knowledge of the TCR binding partners is required. TCR epitopes comprise proteins of the major histocompatibility complex (MHC), the presented (self-) peptide, and the chemical allergen in the case of ACD. Unusually high frequencies of metal- and TNBS-specific CD154+CD4+ T cells were observed in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from allergic and non-allergic donors. Due to significantly higher frequencies, some nickel and cobalt allergic individuals could be distinguished from non‑allergic individuals. The specificity of the activated T cells was confirmed by analysing additional activation markers. Furthermore, the first evidence for the in vivo relevance of the identified metal‑specific T cells emerged. The metal‑specific T cell activation was TCR-mediated and MHC‑dependent, as shown by single clone restimulation. Several mechanisms of chemical allergen recognition by T cells underlying the unusually strong T cell activation were elucidated by analysis of the TCR repertoires and improved bioinformatic data processing. Thereby, specific binding sites for metal ions and TNBS were identified in the TCR of chemical-specific T cells. Metal-specific TCR more frequently contained individual variable gene segments. Among metal‑specific TCR, the protein segments encoded by the gene segments TRAV9-2, TRAV2 and the TRBV4 family were involved in the binding of Ni2+, Co2+ or Pd2+ ions, respectively. In the case of Ni2+, the results confirmed the relevance of a previous literature report on one Ni2+-specific TRAV9-2+ T cell clone2. As a second, independent mechanism of chemical-specific T cell activation, the binding of allergens to amino acids in the complementary determining region 3 (CDR3) was described for the first time. The CDR3 is the most variable binding site of the TCR. For metal ions, histidine was the preferred binding partner. The interacting histidine residue within the CDR3 was not restricted to a particular position. In contrast, binding of TNBS to CD154+CD4+ and CD137+CD8+ T cells occurred selectively to a lysine or tryptophan residue at a specific position in the CDR3 of the TCR β-chain. The shared binding of different metal ions to a certain CDR3 histidine residue suggests the cross-reactivity of the TCR involved. Cross-reactivity is the recognition of different metal allergen-induced epitopes by the same T cell, e.g. by interchangeable metal ion binding. Cross-reactivity can hardly be assessed by patch testing. An alternative is the combination of the AIM assay, TCR HTS, and bioinformatic data analysis for intra- and interindividual TCR congruence analysis, which was further developed in this work. Extensive cross-reactivity of metal-specific TCR associated with the identified repertoire features was also observed and confirmed on a single T cell clone level. Challenges in developing novel in vitro T cell assays to detect chemical-specific T cells include assessing the toxicity and fluorescence interferences of the chemicals used. In addition, the nature of chemical‑induced T cell epitope formation must be considered for each new chemical. AIM T cell assays offer an efficient solution to these challenges, as this thesis demonstrates. Therefore, AIM T cell assays can potentially establish the next generation of in vitro assays for allergy diagnosis and regulatory risk assessment.
Die allergische Kontaktdermatitis (allergic contact dermatitis, ACD) ist eine T-Zell-vermittelte Erkrankung. Etwa 20 % der Bevölkerung in Industriestaaten sind von mindestens einer Kontaktallergie betroffen1. Bislang wurde eine in vitro T-Zellaktivierung aufgrund technischer Limitationen jedoch nur für einige wenige Kontaktallergene beschrieben. Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein Assay entwickelt, der mittels Aktivierungs-induzierten Oberflächenmarkern (activation-induced marker, AIM) in Kombination mit Durchflusszytometrie die T‑Zellaktivierung nach Stimulation mit chemischen Allergenen detektiert. Für diese Arbeit wurden die Metallsalze NiSO4, CoCl2 und PdCl2 sowie das organische Modellallergen 2,4,6‑Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) als chemische Allergene ausgewählt. Die mRNA der an der Aktivierung beteiligten T-Zell-Rezeptoren (TZR) wurde mittels Hochdurchsatzsequenzierung (high‑throughput sequencing, HTS) sequenziert. Der AIM-T-Zell-Assay ermöglicht eine schnelle, sensitive, quantitative und umfassende Analyse Allergen‑spezifischer, naïver und Gedächtnis CD154+CD4+- oder CD137+CD8+ T-Zellen. Parallel können weitere assoziierte Oberflächen- und intrazelluläre Marker, exprimierte Zytokine und das TZR‑Repertoire untersucht werden. Darüber hinaus sind keine vorherigen Kenntnisse über die beteiligten TZR‑Bindungspartner nötig. Mögliche Bindungspartner sind der Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex, MHC), das präsentierte Selbstpeptid und, im Falle der ACD, das chemische Allergen. Die Durchführung des AIM-Assays erlaubt die Verwendung hoher Konzentrationen des chemischen Allergens, die es ermöglichen den gesamten reaktiven T-Zell-Pool zu erfassen. Ungewöhnlich hohe Frequenzen metall- und TNBS-spezifischer CD154+ CD4+ Gedächtnis-T-Zellen wurden in mononukleären Zellen des peripheren Blutes (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) von allergischen und nichtallergischen Spendern beobachtet. Nur einige Nickel- und/oder Kobaltallergiker konnten aufgrund deutlich höherer Frequenzen von Nichtallergikern unterschieden werden. Die Spezifität der aktivierten T-Zellen wurde durch die Analyse zusätzlicher Marker bestätigt. Weiterhin ergaben sich erste Hinweise auf die in vivo Relevanz der identifizierten Metall-spezifischen T-Zellen. Die Aktivierung war TZR-vermittelt und MHC‑abhängig, wie die Restimulation einzelner Klone zeigte.
Mehrere Mechanismen der Allergenerkennung von T-Zellen, die der ungewöhnlich starken T‑Zellaktivierung zugrunde liegen, wurden durch die Analyse des TZR-Repertoires aufgeklärt. Im TZR Chemikalien-spezifischer T-Zellen wurden spezifische Bindungsstellen für Metallionen und TNBS identifiziert. Metall-spezifische TZR exprimierten signifikant häufiger bestimmte variable Gensegmente. Im Fall von Ni2+ wurde damit die Relevanz eines früheren Berichts aus der Literatur über einen Ni2+‑spezifischen TRAV9-2+ T-Zell-Klon bestätigt2. Ein zweiter, unabhängiger Mechanismus der Chemikalien-spezifischen T-Zellaktivierung ist die Bindung von Allergenen an Aminosäuren in der komplementaritätsbestimmenden Region 3 (complementary determining region 3, CDR3), der variabelsten Bindungsstelle des TZR. Für Metallionen war ein Histidin die bevorzugte Bindungsstelle in der CDR3. Die exakte Position des Histidins innerhalb der CDR3‑Sequenz war dabei allerdings variabel. Die Bindung von TNBS an CD154+CD4+ und CD137+CD8+ T-Zellen erfolgte im Gegensatz dazu spezifisch an ein Lysin oder Tryptophan an einer bestimmten Stelle der CDR3 der TZR β-Kette. Die Bindung von verschiedenen Metallionen an ein CDR3-Histidin deutet auf eine Kreuzreaktivität der beteiligten TZR hin. Kreuzreaktivität ist die Erkennung verschiedener Metallallergen-induzierter Epitope oder Metallionen durch dieselbe T-Zelle. Eine solche Kreuzreaktivität kann nur schlecht durch Patch-Tests beurteilt werden. Eine Alternative zum Patch-Test stellt die Kombination aus AIM-Assay, TZR HTS und bioinformatischer Datenanalyse für die intra- und interindividuelle TZR-Kongruenzanalyse dar, die in dieser Arbeit weiterentwickelt wurde. Es wurde eine umfangreiche Kreuzreaktivität der metall-spezifischen TZR beobachtet, die mit den identifizierten Repertoire-Merkmalen einhergeht. Diese Kreuzreaktivität wurde für einzelne T-Zell-klone bestätigt. Die Herausforderungen bei der Entwicklung neuartiger in vitro T-Zell-Assays zum Nachweis Chemikalien-spezifischer T-Zellen sind unter anderem die Bewertung der Toxizität und der Fluoreszenz-Interferenzen der eingesetzten Chemikalie. Zusätzlich muss die Art der Chemikalien‑induzierten T-Zell-Epitopbildung für jede neue Chemikalie analysiert werden. Der AIM T‑Zell Assay bietet eine effiziente Lösung für diese Herausforderungen. Daher hat der AIM T-Zell Assay das Potenzial, die nächste Generation von in vitro Tests für die Allergiediagnose und die regulatorische Risikobewertung zu begründen.
