The underlying mechanisms that govern neuronal communication through synaptic transmission have been the object of study for decades. Neurotransmission requires of a presynaptic bouton where specialized secretory organelles, synaptic vesicles (SVs), reside. In the SV secretory pathway, neurotransmitter-filled vesicles are actively localized at specialized zones of the presynaptic plasma membrane and subsequently primed in a fusion ready state. These ready-to-fuse SVs form the readily releasable pool, and their spatial organization is carried out by a set of docking/priming factors that spatially couple calcium-channels and SVs. The fusion step of the SVs with the plasma membrane is tightly controlled by an exocytotic fusion machinery composed by SNARE proteins and a calcium sensor. The neuronal calcium-sensing protein Synaptotagmin-1 (SYT1) is responsible for the temporal precision of fast synchronous fusion in response to local calcium entry through voltage-gated calcium-channels. Upon Ca2+-binding SYT1 reduce the energy barrier between SVs and the plasma membrane, coupling calcium-influx with SV fusion. Experiments performed with genetically modified neurons suggested that SYT1 might play two additional roles, regulating spontaneous neurotransmitter release, clamping the SNARE complex in the absence of an action potential, and priming SVs. In this study, we perform electrophysiological recordings on primary mouse hippocampal glutamatergic neurons to explore how the absence of SYT1 affects neurotransmitter release and how this mechanism evolves during the development of synapses. Furthermore, by the systematic genetic manipulation using lentiviral vectors and immunocytochemistry quantification of SYT1 protein expression levels, we dissect its triple synaptic function, gaining insights into their mechanisms. Recently, another isoform of the synaptotagmin family, Synaptotagmin-7 (SYT7), has been suggested to be involved in neurotransmitter release. Due to the overlapping yet partially independent functions of SYT1 and SYT7, the direct contribution of SYT7 to neurotransmission in the absent of SYT1 is unclear. We report that SYT1 and SYT7 have both redundant and antagonistic roles in different aspects of the SV exocytotic pathway. Finally, this study not only deepens in our understanding on how those two presynaptic proteins operate but also provides with insights into how presynaptic malfunction could be the underlying cause of the cellular pathophysiology of neurodevelopmental disorders.
Die zugrundeliegenden Mechanismen, die die neuronale Kommunikation durch synaptische Übertragung steuern, werden seit Jahrzehnten in zahlreichen Studien untersucht. Die Neurotransmission erfolgt im präsynaptischen Bouton, in dem sich spezialisierte sekretorische Organellen, die synaptischen Vesikel (SVs), befinden. Diese Vesikel, welche mit Neurotransmittern gefüllt sind, werden an spezialisierten Zonen der präsynaptischen Plasmamembran lokalisiert und anschließend in einen fusionsbereiten Zustand gebracht. Diese fusionsbereiten SVs bilden den leicht freisetzbaren Pool, und ihre räumliche Organisation erfolgt durch eine Reihe von Docking/Priming-Faktoren, wodurch Kalziumkanäle und SVs räumlich gekoppelt werden. Der Fusionsschritt der SVs mit der Plasmamembran wird durch eine exozytotische Fusionsmaschinerie, bestehend aus SNARE-Proteinen und einem Kalziumsensor, genauestens kontrolliert. Das neuronale Kalzium-Sensorprotein Synaptotagmin-1 (SYT1) ist für die zeitliche Präzision der schnellen synchronen Fusion als Reaktion auf den lokalen Kalziumeinstrom durch spannungsabhängige Kalziumkanäle verantwortlich. Nach der Kalziumbindung verringert SYT1 die Energiebarriere zwischen SVs und der Plasmamembran und koppelt den Kalziumeinstrom mit der SV-Fusion. Experimente mit genetisch veränderten Neuronen deuten darauf hin, dass SYT1 zwei weitere Rollen haben könnte: es reguliert die spontane Freisetzung von Neurotransmittern, sorgt für die Klemmung des SNARE-Komplexes in Abwesenheit eines Aktionspotenzials und kontrolliert das "Priming" der SVs. In dieser Studie führen wir elektrophysiologische Ableitungen an primären glutamatergen Neuronen des Hippocampus der Maus durch, um zu erforschen, wie sich das Fehlen von SYT1 auf die Freisetzung von Neurotransmittern auswirkt und wie sich dieser Mechanismus während der Entwicklung von Synapsen entwickelt. Durch die systematische genetische Manipulation mit lentiviralen Vektoren und die immunzytochemische Quantifizierung der SYT1-Proteinexpression untersuchen wir die synaptische Funktion von SYT1 und erhalten so Einblicke in ihre Mechanismen. Kürzlich wurde eine weitere Isoform der Synaptotagmin-Familie, Synaptotagmin-7 (SYT7), mit der Freisetzung von Neurotransmittern in Verbindung gebracht. Aufgrund der sich überschneidenden, aber teilweise unabhängigen Funktionen von SYT1 und SYT7 ist der direkte Beitrag von SYT7 zur Neurotransmission in Abwesenheit von SYT1 unklar. Wir berichten, dass SYT1 und SYT7 sowohl redundante als auch antagonistische Funktionen in verschiedenen Aspekten des exozytotischen Weges der SV haben. Schließlich vertieft unsere Studie nicht nur unser Verständnis der Funktionsweise dieser beiden präsynaptischen Proteine, sondern liefert auch Erkenntnisse darüber, wie eine präsynaptische Fehlfunktion die zugrundeliegende Ursache für die zelluläre Pathophysiologie von neurodegenerativen Erkrankungen sein könnte.
