A novel contiguity-preserving sequencing approach was developed and tested – paired indexing at tagmentation sites (PITS). The idea of the method is to use paired indices to individually label pairs of DNA molecule ends originating at tagmentation sites. Indices from the same pair on the ends of two sequencing library fragments would mean that those fragments were next to each other in the original molecule. Thus after getting separated in the way it occurs in a standard sequencing library preparation protocol library, fragments after sequencing would be assembled again and the contiguity of the sequence would be restored. Convenient system for testing of the PITS method was chosen and proof-of-principle experiment was performed. Though few, scaffolds containing up to 4 subsequent library molecules were assembled. Some of the constraints of the PITS approach were revealed and optimization possibilities for future work were determined. A patent application describing the PITS protocol is in preparation. During the course of this PhD, an efficient method for preparation of sequencing library from amol amounts of tagmentation products has been established – post tagmentation ultra low input (PTULI) protocol. The method aims at preserving possibly all tagmentation fragments throughout sequencing library preparation process. The developed protocol provides detailed instructions on the controls setup and guidelines for subsequent non- residual loading of the PTULI library on a sequencer. The PTULI library preparation strategy is suitable for PITS, and is also of value for other minute input material sequencing applications. To make contiguity-preserving sequencing work possible, in-house Tn5 transposase was prepared. Applications of this enzyme within the settings other than those in commercially available kits are hardly known and further development of the PITS approach to a great extent depends on the potential of this enzyme. That is why in parallel to the PITS method itself, Tn5 properties were studied. An electrophoresis free assay for characterizing Tn5 transposomes fragmentation efficiency was developed and published [Rykalina et al., 2017]. This assay is a convenient monitoring system for the setup of tagmentation protocols and for optimization experiments.
Es wurde ein neuartiger Kontiguität-bewahrender Sequenzierungsansatz entwickelt und getestet: gepaarte Indizierung an Tagmentationsstellen (Paired Indexing at Tagmentation Sites - PITS). Die Idee der Methode besteht darin, die Paare der DNA-Molekül-Enden, die ursprünglich von Tagmentationsstellen stammen, individuell mit gepaarten Indizes zu markieren. Gleiche Indizes an den Enden der zwei sequenzierten Bibliotheksfragmente würde bedeuten, dass diese Fragmente im ursprünglichen Molekül nebeneinander angeordnet waren. Dank dieser Methode werden die Fragmente, die während der Herstellung von Sequenzierungsbibliotheken getrennt wurden, wieder zusammengesetzt und damit die Kontiguität der Sequenz der ursprünglichen DNA-Moleküle wiederhergestellt. Es wurde ein praktisches System für die Prüfung der PITS-Methode gewählt und ein proof-of-principle Experiment durchgeführt. DNA Ketten mit bis zu vier nachfolgenden Bibliotheksmolekülen wurden zusammengebaut. Einige der Einschränkungen des PITS-Ansatzes wurden aufgedeckt und Optimierungsmöglichkeiten für zukünftige Arbeiten ermittelt. Eine Patentanmeldung, die das PITS-Protokoll beschreibt, ist in Vorbereitung. Im Rahmen der Arbeit wurde ein effizientes Verfahren zur Herstellung von Sequenzierungsbibliotheken aus amol-Mengen von Tagmentationsprodukten etabliert, das Post-Tagmentation Ultra Low Input (PTULI) Protokoll. Die Methode zielt darauf ab, möglichst alle Tagmentierungsfragmente während des gesamten Prozesses zur Vorbereitung der Sequenzierungsbibliotheken zu bewahren. Das entwickelte Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zum Steuerungs-Setup und Richtlinien für die anschließende komplette Beladung der PTULI-Bibliothek auf einem Sequenzer. Die PTULI- Bibliotheksvorbereitungsstrategie eignet sich nicht nur für PITS, sondern auch für andere Sequenzierungsanwendungen mit geringen Input. Um dieses Projekt zu ermöglichen, wurde eine eigene Tn5-Transposase hergestellt. Anwendungen dieses Enzyms in anderen settings als in handelsüblichen Kits sind kaum bekannt und die Weiterentwicklung des PITS-Ansatzes hängt weitgehend von dem Potenzial dieses Enzyms ab. Deshalb wurden parallel zur PITS-Methode selbst Tn5-Eigenschaften untersucht. Ein elektrophoresefreier Assay zur Charakterisierung von Tn5-Transposomen Fragmentierungseffizienz wurde entwickelt und veröffentlicht [Rykalina et al., 2017]. Dieser Assay bietet ein bequemes Monitoring-System für den Aufbau von Tagmentationsprotokollen und für Optimierungsexperimente.
