Background Cytochrome P450 (CYP)-dependent arachidonic acid (AA) metabolism is increasingly recognized to play an important role in the regulation of renal vascular and tubular function. The primary metabolites involve 20-hydroxyeicosatetraenoic acid (20-HETE) and a series of regioisomeric epoxyeicosatrienoic acids (EETs). 20-HETE is produced by CYP4A and CYP4F and EETs by CYP2C and CYP2J isoforms. EETS can be further converted by CYP4A- catalyzed hydroxylation to hydroxy-epoxyeicosatrienoic acids (HEETs). Providing a starting point for the present study, it was found that the CYP- dependent renal AA metabolism to EETs and HEETs is strongly downregulated in a rat model of angiotensin II (ANG II)-induced hypertension and inflammatory end-organ damage. Objectives: This study is part of a long-term project aimed at elucidating new possibilities for the treatment of hypertension and end- organ damage by directly influencing the renal CYP-dependent AA metabolism. The specific aims were as follows: (i) to test the effect of the PPARα activator fenofibrate on the recovery of renal CYP-dependent EET and HEET production in a rat model of ANG II-induced hypertension and end-organ damage (ii) to analyze the CYP-dependent metabolism of fish oil ω-3 polyunsaturated fatty acids (ω-3 PUFAs), such as eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA), as a source of alternative physiologically active eicosanoids. Results A. Regulation of renal CYP-dependent EET/HEET production by fenofibrate 1\. Double transgenic rats overexpressing human renin and angiotensinogen (dTGR) and Sprague-Dawley (SD) control rats were treated for three weeks with fenofibrate. Fenofibrate treatment normalized blood pressure and kidney function and resulted in: • a significant increase in renal microsomal EET production: 2.2 fold for dTGR-Fenofibrate vs. untreated dTGR, and 2.5–fold for SD-Fenofibrate vs. untreated SD. • a significant increase in renal microsomal HEET production: 6-fold in dTGR and 3,5-fold in SD rats. 2\. CYP2C23 was identified as the predominant renal AA epoxygenase in dTGR and SD rats. CYP2C23 protein expression was strongly induced by Fenofibrate under both pathological and physiological conditions. 3\. A novel pathway of HEET formation was discovered. Rat renal microsomes produced HEETs predominantly via CYP2C23-catalyzed epoxidation of 20-HETE and only to a minor extent by the formerly known CYP4A-catalyzed EET hydroxylation. B. Omega-6 and Omega-3 Fatty Acids as Substrates for Cytochrome P450 Enzymes 1\. Enzymatically active CYP isoforms were produced in a baculovirus/insect cell system. The CYP isoforms analyzed included the major AA hydroxylases from human (CYP4A11 and CYP4F2), and mouse (Cyp4a12a and Cyp4a12b) as well as the AA epoxygenases from human (CYP2C8 and CYP2C9), and rat (CYP2C11 and CYP2C23). 2\. The recombinant CYP enzymes converted EPA, DHA and DPA (docosapentaenoic acid) with catalytic efficiencies almost equal or even higher compared to AA. 3\. The CYP4A and CYP4F enzymes, which preferentially function as AA -hydroxylases, showed a less strict regioselectivity with the ω-3-PUFAs and additionally epoxidized the ω-3 double bond. For example, CYP4A11 displayed a ratio of : (-1) hydroxylation of 85: 15 with AA, 31: 69 with EPA and 50: 50 with DHA. 4\. The CYP2C enzymes produced isoform-specific patterns of regioisomeric epoxy- derivatives from EPA, DPA and DHA. Moreover the regiospecificity was substrate-dependent. For example, CYP2C23 epoxidized AA preferentially at the 11,12-, EPA at the 17,18-, DPA at the 10,11- and DHA at 10,11- and 19,20-double bonds. 5\. All epoxygenases except CYP2C9 preferentially attacked the ω-3 double bonds of EPA and DHA. Chiral-phase HPLC revealed that each CYP isoforms has a distinct stereoselectivity when epoxidizing the 17,18-double bond of EPA. Conclusions The present study shows that treatments with PPARα activators and with ω-3 PUFAs may represent promising approaches to influence the CYP-dependent renal AA metabolism under physiological and pathological conditions. The PPARα activator fenofibrate acts as a strong inducer of CYP2C23-catalyzed EET and HEET generation and protects against ANG II-induced hypertension and renal damage. These results suggest that CYP-dependent EET/HEET production may serve as an anti-inflammatory control mechanism. The second part of the studies demonstrates that EPA, DHA and DPA are efficient alternative substrates of major AA metabolizing CYP isoforms. Therefore, diets rich in ω-3 PUFAs can be expected to significantly modulate the production of physiologically active metabolites by CYP enzymes in various tissues and organs. This shift in CYP-dependent eicosanoid formation may play an important role in mediating the beneficial cardiovascular effects of ω-3 PUFAs.
Hintergrund Der Cytochrom P450 (CYP)-abhängiger Arachidonsäure (AA) Metabolismus wird zunehmend als wichtiger Bestandteil der Regulation renaler Gefäß- und Tubulusfunktionen wahrgenommen. Primärmetablite sind 20-Hydroxyeikosatetraensäure (20-HETE) und eine Reihe regioisomerer Epoxyeikosatriensäuren (EETs). 20-HETE wird von CYP4A und CYP4F und EETs von CYP2C und CYP2J Isoformen gebildet. EETs können von den CYP4A Isoformen weiter zu Hydroxy-Epoxyeikosatriensäuren (HEETs) hydroxyliert werden. Ausgangspunkt für diese Studie war die Erkenntnis, dass in der Niere eines Rattenmodell mit Angiotnesin II (ANG II)-induziertem Bluthochdruck und endzündlichem Endorganschaden der CYP-abhängige AA-Metabolismus zu EETs und HEETs stark herunter reguliert ist. Zielsetzung Diese Studie ist Teil eines Langzeitprojektes zur Entwicklung neuer Möglichkeiten der Behandlung von Bluthochdruck und Endorganschäden durch direkte Beeinflussung des CYP- abhängige AA-Metabolismus in der Niere. Die spezifischen Ziele waren folgende: (i) Klärung des Effektes des PPARα Aktivators Fenofibrat auf die Erholung der CYP-abhängigen EET und HEET Bildung im Rattenmodell mit ANG II-induziertem Bluthochdruck und endzündlichem Endorganschaden (ii) Analyse des CYP- abhängigen Metabolismus von ω-3 mehrfachungesättigten Fettsäuren (ω-3 PUFAs) aus Fischöl, wie beispielsweise Eikosapentaensäure (EPA) und Docosahexaensäure (DHA), als Quelle alternativer physiologisch aktiver Eikosanoide. Ergebnisse A. Regulation der renalen CYP-abhängigen EET und HEET Bildung durch Fenofibrat 1\. Doppelt-transgene Ratten mit einer Überexpression des humanen Renin und Angiotensinogen (dTGR) und Sprague-Dawley (SD) Kontrollratten wurden für drei Wochen mit Fenofibrat behandelt. Die Fenofibrat Behandlung hatte eine Normalisierung von Blutdruck und Nierenfunktion zur Folge und führte zu: einen signifikanten Anstieg der renalen mikrosomalen EET Produktion: 2,2 fach für dTGR-Fenofibrat vs. unbehandelte dTGR und 2,5 fach für SD-Fenofibrat vs. untreated SD einen signifikanten Anstieg in renaler mikrosomaler HEET Produktion: 6 fach in dTGR und 3,5 fach in SD Ratten. 2\. CYP2C23 wurde als vorherrschende renale AA Epoxygenase in dTGR und SD Ratten identifiziert. Die CYP2C23 Protein Expression wurde durch Fenofibrat Behandlung stark induziert, sowohl unter pathologischen als auch unter physiologischen Bedingungen. 3\. Ein neuer Weg der HEET Bildung wurde entdeckt. Rattennierenmikrosomen bilden HEETs hauptsächlich über CYP2C23 katalysierte Epoxydation von 20-HETE und nur zu einem geringen Teil über die bereits bekannte CYP4A-katalysierte EET Hydroxylierung. B. Omega-6 und Omega-3 Fettsäuren als Substrate für Cytochrom P450 Enzyme 1\. Enzymatisch aktive CYP Isoformen wurden in einerm Baculovirus/Insektenzellsystem hergestellt. Die analysierten CYP-Isoformen beinhalteten die wichtigsten AA Hydroxylasen des Menschen (CYP4A11 und CYP4F2) und der Maus (Cyp4a12a und Cyp4a12b), sowie die AA Epoxygenasen des Menschen (CYP2C8 und CYP2C9) und der Ratte (CYP2C11 und CYP2C23). 2\. Die rekombinanten CYP Enzyme wandelten EPA, DHA und DPA (Docosapentaensäure) mit vergleichbarer oder sogar höherer katalytischer Effizienz als AA um. 3\. Die CYP4A und CYP4F Enzyme, die vorrangig als AA Hydroxylasen fungieren, zeigten eine weniger strikte Regioselektivität mit ω-3 PUFAs und epoxidierten zusätzlich die ω-3 Doppelbindung. Zum Beispiel zeigte CYP4A11 ein : (-1) Hydroxylierungsverhältnis von 85: 15 bei AA, 31: 69 bei EPA und 50: 50 bei DHA. 4\. Die CYP2C Enzyme produzierten Isoform-spezifische Muster regioisomerer Epoxyderivate von EPA, DPA und DHA. Zudem war die Regiospezifität substratabhängig. Zum Beispiel epoxydierte CYP2C23 bei AA vorrangig die 11,12-, bei EPA die 17,18-, DPA und die 10,11- und bei DHA die 10,11- und die 19,20-Doppelbindung. 5\. Alle Epoxygenasen außer CYP2C9 griffen vorrangig an der ω-3 Doppelbindung von EPA und DHA an. Chiral-Phasen HPLC zeigte, dass jede CYP Isoform eine deutliche Stereoselektivität bei der Epoxydation der 17,18-Doppelbindung von EPA hatte. Schlußfolgerung Die vorliegende Studie zeigt, dass eine Behandlung mit PPARα Aktivatoren und mit ω-3 PUFAs ein vielversprechenden Ansatz zur Beeinflussung des CYP-abhängigen renalen AA-Metabolismus unter physiologischen und pathologischen Bedingungen sein könnte. Der PPARα Aktivator Fenofibrat induziert die CYP2C23-katalysierte EET und HEET Bildung stark und schütz vor ANG II-induziertem Bluthochdruck und Endorganschaden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die CYP-abhängige EET/HEET Produktion als antiinflammatorischer Kontrollmechanismus dienen könnte. Der zweite Teil der Studie zeigt, dass EPA, DHA und DPA effiziente Substrate für die hauptsächlich AA metaboliierenden CYP Isoformen sind. Daher kann man erwarten, dass Diäten, die reich an ω-3 PUFAs sind, die Produktion physiologisch aktiver Metabolite durch CYP Enzyme in verschiedensten Geweben und Organen signifikant verändern. Diese Veränderung der CYP-abhängigen Eikosanoidbildung könnte eine wichtige Rolle in der Vermittlung der heilsamen kardiovaskkulären Effekte von ω-3 PUFAs spielen.
