The ability of enzymes to accelerate reactions while maintaining excellent substrate selectivity and product specificity has interested chemists for decades. The adaptation of enzymes to the reaction conditions of chemical synthesis has, however, been met with numerous obstacles such as reduced solubility, thermostability and substrate scope. To overcome these obstacles, protein engineering employs methods of rational design and directed evolution as well as more modern computational and combinatorial approaches. Although these techniques have been successfully applied to alter biocatalysts, our understanding of protein folding and the interactions required for enzyme catalysis remains limited. This is best evidenced by the inability to design de novo catalytic proteins comparable to enzymes. To develop a better understanding of enzyme structure and function, the “bottom-up” approach to the de novo design of catalytic proteins is applied. This minimalistic approach uses simple peptides which predictably self-assemble into well- defined three-dimensional templates, on which catalytic machinery or other functionalities believed to impart a particular property are introduced. The simplified, yet protein-like, environments of the self-assembling peptides allow for enhanced clarity of the individual interactions to assess how such interactions contribute to particular enzymatic properties. Using the bottom- up technique, catalytic machinery for esterase-like activity was incorporated into three model peptide systems. The insertion of histidine into the carboxylate-rich E3 peptide resulted in a random coil with slight catalytic activity. This activity was muted when fixed in a heterodimeric coiled coil with K3 showing an enzyme-like sensitivity to its environment. In addition, the fibril-forming Ac-IHIHIQI-NH2, which uses histidine-coordinated zinc to activate water, was found to be more selective for hydrophobic, L-amino acid esters while in the process of self-assembly than when applied as fully-formed fibrils. This finding points to the interaction of hydrophobic substrate moieties with exposed hydrophobic surfaces of the assembling β-sheets. Lastly, zinc was introduced to a hexameric α-helical coiled coil featuring six histidine residues in its hydrophobic interior. The coordination of zinc within a water-accessible, substrate accommodating cleft was found to greatly accelerate ester hydrolysis.
Die Fähigkeit von Enzymen, Reaktionen unter Erhalt einer exzellenten Substrat- und Produktspezifität zu beschleunigen, interessiert Chemiker seit Jahrzehnten. Bei der Adaption von Enzymen für die Bedingungen der Synthesechemie entstanden jedoch zahlreiche Hindernisse, wie bspw. eine verringerte Löslichkeit und Thermostabilität sowie eine geringere Substratvielfalt. Für die Bewältigung dieser Probleme nutzt das protein engineering sowohl Methoden des rationalen Designs und gerichteter Evolution, als auch moderne computergestützte sowie kombinatorische Ansätze. Obwohl diese Techniken zur Entwicklung zahlreicher Biokatalysatoren erfolgreich eingesetzt wurden, bleibt das Verständnis über die Proteinfaltung und Wechselwirkungen, welche für die enzymatische Katalyse erforderlich sind, weiterhin begrenzt. Dies wird vor allem dadurch belegt, dass es unmöglich ist, katalytisch aktive Proteine de novo zu generieren, die ähnliche Fähigkeiten aufweisen wie Enzyme. Um ein besseres Verständnis von der Enzymstruktur und Funktion zu ermöglichen, wird der „bottom-up“-Ansatz für das de novo Design von katalytisch aktiven Proteinen genutzt. Dieser minimalistische Ansatz nutzt einfache Peptide mit vorhersagbaren Selbstorganisationseigenschaften zu gut definierten dreidimensionalen Templaten. In diese Template wird katalytische Aktivität bzw. werden andere Funktionalitäten eingebaut. Die vereinfachten, dennoch proteinartigen Systeme ermöglichen ein verbessertes Verständnis darüber, wie einzelne Wechselwirkungen zu bestimmten enzymatischen Eigenschaften beitragen können. Unter Einsatz der „bottom-up“-Technik wurde der enzymatische Apparat für eine Esterase-artige Aktivität in drei Modellpeptide eingeführt. Der Einbau von Histidin in das Carboxylat-reiche Peptid E3 führte zu einem random coil mit einer geringen katalytischen Aktivität. Als das Peptid mit K3 in einem heterodimeren coiled coil fixiert wurde, nahm die Aktivität ab, aber das Peptid zeigte eine enzymartige Sensitivität. Außerdem wurde festgestellt, dass Ac-IHIHQI-NH2, welches ein Histidin-koordiniertes Zink für die Aktivierung von Wasser besitzt, eine höhere Selektivität für hydrophobe L-Aminosäureester besitzt, wenn die Wechselwirkung mit dem Substrat während des Prozesses der Selbstaggregation besitzt, als im Vergleich zu vollständig aggregiertem Zustand. Diese Beobachtung deutet auf die Wechselwirkung von hydrophoben Substratresten mit der hydrophoben Oberfläche der aggregierenden β-Faltblätter. Zum Schluss wurde Zink in ein hexameres α-helikales coiled coil mit sechs Histidinresten im hydrophoben Kern eingeführt. Es zeigte sich, dass die Koordination von Zink in einem für Wasser zugänglichen und Substrat- aufnehmenden Spalt die Esterhydrolyse stark beschleunigte.
