dc.contributor.author
Balszuweit, Frank
dc.date.accessioned
2018-06-07T17:28:09Z
dc.date.available
2005-07-13T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/3878
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-8078
dc.description
Titel
1\. Einleitung 7
2\. Zielstellungen der vorliegenden Arbeit 15
3\. Materialien und Methoden 17
4\. Ergebnisse 33
5\. Zusammenfassende Diskussion und Ausblick 105
6\. Zusammenfassung/Summary 122
Anhang A: Strukturformeln der Farbstoffe und Amine 126
Anhang B zu Ziffer 4.1.1.3: Validierungsdaten 132
Anhang C: Freisetzung von Aminen bei Standard-Experimenten gemäß Ziffer
4.2.3.2 134
Anhang D: Diagramme und Messdaten zu Ziffer 4.5, Korrelation zwischen
Substratmenge und Amin-Freisetzung 138
Anhang E: Diagramme und Messdaten zur Kinetik, Beispiele einer sich
beschleunigenden Freisetzung 147
Literaturverzeichnis 154
dc.description.abstract
Die Fähigkeit zur enzymatischen Spaltung von Azofarbstoffen in primäre
aromatische Amine ist unter typischen Stämmen der menschlichen Hautflora weit
verbreitet. In den hier verwendeten in-vitro Modellen wurden sowohl für Mono-
als auch Diazoverbindungen, wasserlösliche als wasserunlösliche Verbindungen
die Freisetzung des primären aromatischen Amins nachgewiesen. Die Ergebnisse
der Untersuchung der durch die Kosmetik-Verordnung zugelassenen Azofarbstoffe
geben Anlass, die Verwendung von mindestens drei der vier Farbstoffe dringend
zu überdenken, da aus ihnen Spaltprodukte entstehen können, die im Verdacht
stehen, krebsauslösend zu wirken5,6. Weiterhin unterstreichen die
Messergebnisse, dass das für eine Reihe von Azofarbstoffen bereits in Kraft
getretene Verbot der Verwendung in Bekleidungsgegenständen aus Textilien und
Leder, das Verkehrverbot für damit behandelte Bedarfsgegenstände und die damit
im Zusammenhang stehenden Maßnahmen der Überwachung zum Schutz des
Verbrauchers sinnvoll und notwendig sind. Azofarbstoffe können prinzipiell
bereits unter aeroben Bedingungen durch die Mikroorganismen gespalten werden.
Unter anaeroben Bedingungen läuft die Azospaltung deutlich schneller ab, für
einige der hier getesteten Farbstoffe waren die Spaltprodukte erst bei
Inkubation unter anaeroben Bedingungen nachweisbar. Das von Platzek und Lang
entwickelte und im Rahmen dieser Arbeit optimierte Standard-Experiment eignet
sich, um Messergebnisse von sehr guter intra-day-Reproduzierbarkeit
aufzunehmen. Eine Reproduzierbarkeit der Ergebnisse von Arbeitsgang zu
Arbeitsgang ist aufgrund der Komplexität eines biologischen Systems und der
Vielzahl der auf das Endergebnis einwirkenden Parameter mit der derzeitigen
Versuchsanordnung nicht zu erzielen. Innerhalb eines Arbeitsgangs ist es
jedoch möglich, durch gezieltes Variieren bestimmter Parameter deren Einfluss
auf den Verlauf der Azospaltung zu beleuchten. Zwischen der Konzentration des
Farbstoffs im Assay und der Menge des freigesetzten Amins besteht im unteren
Konzentrationsbereich eine eindeutige lineare Korrelation. Nach Erreichen
einer bestimmten Sättigungskonzentration bewirkt die weitere Erhöhung der
Farbstoff-Konzentration keine zusätzliche Beschleunigung der Freisetzungs-
Reaktion. Bei anaerober Inkubation unter Substratsättigung besteht eine
lineare Korrelation zwischen der Zahl der Bakterien im Assay und der Menge des
freigesetzten Amins. Wird durch die Stoffwechseltätigkeit der Bakterien die
Farbstoff-Konzentration im Assay unter die Sättigungsschwelle gesenkt, so
nimmt die Geschwindigkeit der Freisetzung ab. Ein gleichzeitig ablaufender
Abbau des Amins bewirkt in vielen Fällen, dass sich die Freisetzung und Abbau
des Amins gegenseitig kompensieren und sich dessen Konzentration im Assay
nicht mehr ändert. Der zeitliche Verlauf der Freisetzung der Amine hängt vom
Angebot an Farbstoff, dem Zutritt von Sauerstoff sowie der
Reaktionsfreudigkeit der Amine ab. Unter aeroben Bedingungen lässt sich z.T.
eine Freisetzung gemäß Kinetik 0. Ordnung beobachten. Unter anaeroben
Bedingungen und bei Substratsättigung nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit im
Verlauf der Reaktion in der Regel zu. Eine Verarmung des Assays an Substrat
kann zu abnehmenden Reaktionsgeschwindigkeiten führen. Eine rückläufige Amin-
Konzentration im Assay wurde jedoch nur für die reaktionsfreudigen Vertreter
4-Aminoazobenzen (weitere reduktive Spaltung) und 2,4-Diaminotoluol
(oxidationsempfindlich) beobachtet. Das in vitro Modell ist zur Anwendung auf
weitere Farbstoffe geeignet, z.B. um im Sinne eines worst-case-Versuches
Azofarbstoffe, die aus Proben von Bekleidungs-Gegenständen isoliert wurden,
darauf zu untersuchen, ob sie grundsätzlich einer mikrobiellen Spaltung
zugänglich sind, die in der Freisetzung evtl. krebserzeugender primärer
aromatischer Amine resultieren könnte. Für eine Fortsetzung der Arbeiten gibt
es zwei wichtige Ansätze. Zum einen könnten die bislang in vitro kultivierten
Testkeime auf künstliche bzw. von Versuchtieren gewonnene Haut aufgebracht und
in ein Resorptions-Modell integriert werden, um das tatsächliche Verhalten von
Azofarbstoffen auf der menschlichen Haut besser abschätzen zu können. Zum
anderen sollten das oder die beteiligten Enzyme aus den Zellen isoliert
werden, um in den Arbeiten mit dem isolierten Enzym besser reproduzierbare
Daten zur Kinetik der Umsetzung zu gewinnen, Einblick in die Struktur und
Struktur-Wirkungs-Beziehungen sowie die physiologische Rolle der Enzyme zu
gewinnen.
de
dc.description.abstract
The enzymatic cleavage of azo dyes is a metabolic ability, common among
bacteria strains isolated from the human skin microflora. Using the described
in-vitro model, release of primary aromatic amines was detected, both from
mono and diazo compounds, water-soluble and water-insoluble azo dyes.
According to the results of this investigation, the use of at least 3 of the 4
azo dyes currently approved for use in cosmetics under German legislation
should be reconsidered, as they have been demonstrated to release, by
enzymatic cleavage, aromatic amines, which are suspected to be carcinogenic. A
large number of azo dyes is already prohibited to be used in textiles or
leather intended for prolonged contact with human skin. Clothing and similar
products containing these dyes may no longer be marketed under European and
German legislation. Our results confirm that this prohibition of use as well
as the continued investigations to monitor and thereby enforce compliance with
this legislation are necessary. In general, reductive cleavage of azo dyes may
already occur under aerobic conditions. Under anaerobic conditions, this
reaction is significantly accelerated. For some of the dyes tested, cleavage
products were only detectible under anaerobic conditions. The in vitro model,
developed by Platzek and Lang and optimised during this work, is able to
produce quantitative results with high intra-day reproducibility. Using the
current experimental set-up, inter-day reproducibility of the quantitative
results could not be achieved due to the complexity of biological systems and
the variety of parameters that influence the amount of amine released by
reductive cleavage. However, working with assays from an identical population
of bacteria, it is possible to systematically vary certain parameters and
thereby, study their influence on the reductive azo cleavage. Within the lower
range of concentration, there is a linear correlation between the
concentration of the dye and the amount of amine released. Above a certain
concentration, however, saturation of the enzyme is achieved and further
increase of the dye concentration does not result in an accelerated release of
amine. Under anaerobic conditions and as long as the enzyme was saturated with
substrate (azo dye), there was a linear correlation between the number of
bacteria in the assay and the amount of released amine. When the concentration
of dye was decreased below the level of saturation, the release of amine was
decelerated. In some cases, ongoing release and further metabolic reactions of
the amine compensated each other, resulting in a steady-state. The kinetics of
amine release are dependent upon the concentration of dye (substrate), the
presence or absence of oxygen and possibility of further metabolisation of the
amine. Under aerobic conditions, cases of amine release, following zero order
kinetics were demonstrated. Under anaerobic condition and when a sufficient
amount of azo dye was present, the release of amine was often accelerated over
the course of continued incubation. In contrast, a significant decrease of dye
concentration did result in a decelerated amine release. However, a decrease
of amine concentration in the assay was only observed when the particular
amine was sensitive to further metabolic reactions such as oxidation of
2,4-diaminotoluene or reductive cleavage of 4-aminoazobenzene. The in-vitro
model may be used as a worst case experiment with further azo dyes, including
dyes isolated from consumer products, to investigate whether or not these
particular dyes may release aromatic amines, i.e. suspected carcinogens, by
reductive cleavage. There are two promising approaches to continue the
research on reductive cleavage by skin bacteria. The strains which have been
used in this in vitro model could be grown on artificial skin or samples of
animal skin and thereby, integrated into a resorption model in order to learn
more about the cleavage of azo dyes and subsequent resorption of aromatic
amines under in vivo conditions. Furthermore, the enzyme or enzymes
responsible for reductive azo cleavage of should be isolated. Experiments with
the isolated enzyme are likely to yield more reproducible data on the kinetics
of azo cleavage. Moreover, the enzyme?s structure, structure-activity-
relationships and the physiological role of the enzyme could then be studied.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
human skin flora
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
dc.title
Freisetzung primärer aromatischer Amine aus Azofarbstoffen durch mikrobielle
Spaltung
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Peter Surmann
dc.contributor.furtherReferee
PD Dr. Christine Lang
dc.date.accepted
2005-07-04
dc.date.embargoEnd
2005-07-15
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2005001791
dc.title.subtitle
Quantitative, parametrische und kinetische Aspekte
dc.title.translated
Release of primary aromatic amines from azo dyes by microbiological cleavage
en
dc.title.translatedsubtitle
Quantitative, parametric and kinetic aspects
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
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FUDISS_thesis_000000001660
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2005/179/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000001660
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open access