Dysferlinopathy is a muscular dystrophy that manifests as two major phenotypes: limb-girdle muscular dystrophy type 2B (LGMD2B) or Miyoshi myopathy (MM). It is caused by mutations in the dysferlin gene. Dysferlin is a membrane protein expressed in skeletal muscle. It is responsible for the repair of sarcolemma microlesions produced by muscle contractions. A compromised membrane repair leads to slowly progressing muscle wasting. This thesis explores the therapeutic potential of an antisense mediated splice switching strategy in LGMD2B caused by the missense mutation c4022T>C in the exon 38 of the dysferlin gene. Antisense oligonucleotides and U7 snRNAs delivered by an adeno-associated viral vector were used as tools to trigger exon skipping in vitro and in vivo. The thesis investigates also if the truncated dysferlin maintains a proper membrane localization and its membrane repair ability. The splice switching strategy was developed after a bioinformatic analysis of targeted dysferlin pre-mRNA. The in silico analysis provided numerous exonic splice enhancers (ESEs) as possible targets and showed that exon 37 and 38 are in close proximity suggesting that they could be removed simultaneously. Thirteen AONs masking exon 37, 38 and intron 37-38 of human dysferlin pre-mRNA were designed. The AON-based splice switching strategy was screened in vitro. Out of thirteen AONs only five demonstrated low level of skipping exon 38. The activity of these oligonucleotides was verified in vivo by intramuscular injections in WT mice. None of these AONs was able to evoke detectable skipping of exon 38 or both exon 37 and 38 at the RNA level. As an alternative splice switching strategy U7 snRNA approach was used. Twelve antisense sequences targeting exon 38 were cloned into the U7 snRNA backbone. For screening, the constructs were delivered intramuscularly into MDX mice using AAV2/9 vector. Three out of twelve U7 snRNAs were able to skip exon 37 and 38 simultaneously. The exon skipping activity of these three constructs was also verified in MMex38 dysferlin deficient mice. Two constructs evoked minor exon skipping detectable only at the RNA level. The activity of the three U7 constructs delivered in AAV2/9 was also tested in vitro in C2C12 cells and in MMex38 primary mouse myoblasts. Exon skipping was detected at the RNA level only in C2C12 cells. The thesis investigates also if dysferlin without exons 37 or 38 maintains a proper membrane localization and its membrane repair ability. The truncated dysferlin constructs: Δexon37, Δexon38, Δexon37&38 and the full dysferlin were delivered to dysferlin deficient human primary myoblasts using a lentivirus. The dysferlin functionality was investigated using a membrane wounding assay. The dysferlin without exon37 or without exon37&38 demonstrated the same membrane resealing property as the full dysferlin. Dysferlin without exon 38 performed worse than the full dysferlin, however, still significantly better than the nontransduced dysferlin deficient myotubes. For a localization study of the truncated dysferlin in vitro, immunostainings of transduced dysferlin-deficient myoblasts and myotubes were performed. The full dysferlin was detected as expected at the membrane of the myotubes. The truncated dysferlin constructs did not demonstrate the membrane localization. Furthermore, the truncated dysferlin is expressed less than the full protein and it localizes in the cytoplasm near nuclei.
Dysferlinopathie ist eine Muskeldystrophie, die sich in zwei Hauptphänotypen manifestiert: Gliedergürtelmuskeldystrophie Typ 2B type 2B (LGMD2B) oder Miyoshi Myopathie (MM). Sie wird durch Mutationen im Dysferlin-Gen verursacht. Dysferlin ist ein Membranprotein, das im Skeletmuskel exprimiert wird. Es ist verantwortlich für die Reparatur von Mikroläsionen am Sarkolemm. Nichtfunktionierende Membranreparatur führt zu progressiver Muskelschwäche. Diese Dissertation untersucht die therapeutischen Möglichkeiten einer Antisense-Splice- Switching-Strategie bei LGMD2B, die durch die Missense- Mutation c4022T>C im Exon 38 des Dysferlin-Gens verursacht wird. Antisense- Oligonukleotide und U7 snRNAs, die durch einen adeno-assoziierten viralen Vektor geliefert wurden, sind Werkzeuge, die für das Exon Skipping in vitro und in vivo eingesetzt wurden. Die Splice-Switching-Strategie wurde nach einer bioinformatischen Analyse der Dysferlin PrämRNA entwickelt. Die in silico Analyse hat viele ESEs als mögliche Ziele identifiziert und auch gezeigt, dass Exon 37 und 38 nicht weit auseinanderliegen und eventuell gleichzeitig entfernt werden könnten. Dreizehn AONs, die Exons 37, 38 und Intron 37-38 der humanen Dysferlin Prä-mRNA maskierten, wurden entworfen. Die AON-basierte Splice-Switching-Strategie wurde in vitro getestet. Von den dreizehn AONs erreichten nur fünf ein niedriges Skippingniveau des Exons 38. Die Exon Skippingaktivität dieser vier Oligonukleotide wurde in vivo in WT Mäusen durch intramuskuläre Injektion verifiziert. Keine der AONs war in der Lage, ein detektierbares Skipping des Exons 38 oder der beiden Exons 37 und 38 auf der RNA Ebene zu erreichen. Als alternative Splice-Switching-Strategie wurde U7 snRNA ausgewählt. Dafür wurden zwölf Antisense-Sequenzen, die das Exon 38 gezielt haben, in das U7 snRNA Rückgrat einkloniert. Die Konstrukte wurden mittels AAV2/9 intramuskulär in die MDX Maus injiziert und für das Skippingergebnis untersucht. Drei der zwölf U7 snRNA waren in der Lage, die Exons 37 und 38 gleichzeitig zu entfernen. Bei diesen drei Konstrukten wurde die Exon Skipping Aktivität in vivo bei Dysferlin-defizienten Mäusen (MMex38) getestet. Zwei Konstrukte verursachten ein minimales Exon Skipping, das nur auf RNA-Ebene detektiert wurde. Die Aktivität der U7 snRNAs, die mittels AAV2/9 geliefert wurden, wurde auch in vitro in C2C12 Zellen und in den primären Myoblasten aus der Dysferlin-defizienten Maus (MMex38) getestet. Das Exon- Skipping wurde auf RNA Ebene nur in den C2C12 Myotuben detektiert. Die Dissertation untersucht auch, ob Dysferlin ohne Exons 37 oder 38 am Sarkolemm lokalisiert und ob es noch die Membranreparaturfähigkeit besitzt. Zu diesem Zweck wurden drei Dysferlin- Konstrukte: ΔExon37, ΔExon38, ΔExone37&38 und das native Dysferlin und mittels Lentiviren in die Dysferlin-defizienten humanen primären Myoblasten eingebracht. Die Dysferlin-Funktionalität wurde mit Laser Wounding Assays untersucht. Das Dysferlin ohne Exon 37 und ohne die beiden Exons 37 und 38 verfügt über die gleiche Membranreparaturfähigkeit wie das vollständige Dysferlin. Das Dysferlin ohne Exon 38 schnitt im Laser Wounding Assay zwar schlechter als das vollständige Dysferlin ab, jedoch immer noch besser als die nicht transduzierten Dysferlin-defizienten Myoblasten. Für die Lokalisationsstudie des verkürzten Dysferlins wurden in vitro Immunfärbungen der transduzierten Dysferlin-defizienten humanen primären Myoblasten und Myotuben angefertigt. Das vollständige Dysferlin wurde, wie erwartet, an der Membran der Myotuben entdeckt. Die Immunfärbungen der Myotuben mit den verkürzten Dysferlin-Konstrukten zeigten keine Lokalisierung am Sarkolemm. Es ließ sich ebenfalls beobachten, dass das verkürzte Dysferlin schlechter als das native Dysferlin exprimiert wurde und sich im Zytoplasma in der Nähe der Nuclei akkumulierte.
