SecA ATP-ase is the essential part of the bacterial secretion machinery, which employs the energy of the ATP binding and hydrolysis to push newly synthesized proteins (preproteins) across the cytoplasmic membrane. Due to its importance, SecA has been extensively studied by various experimental techniques. Still, the exact mechanism of SecA’s chemo-mechanical coupling that leads to a successful completion of the translocation process remains unrevealed. The underlying reason for this could be a very complex nature of the translocation process, which involves many factors that are mutually coupled . X-ray studies, for instance, can capture SecA in a certain conformation and NMR could assign dynamical properties to the SecA’s structural elements. The analysis of SecA’s structures obtained in this way, can give predictions of possibly important amino acid residues for SecA function. Later on, these predictions can be confirmed or denied by mutagenesis studies. However, SecA has several hundreds of amino acid residues and a systematic mutagenesis check could demand a significant amount of work and time. Comined together, aforementioned methods provided valuable insights of the SecA function, but failed to answer the question of the mechanism behind aforementioned chemo- mechanical coupling. A promising approach to this problem could be molecular dynamics (MD) simulations. The MD simulations are capable of animating the static SecA structures obtained by the X-ray crystallography and providing information of SecA’s dynamics that could be used for better understanding and explanation of the SecA’s function. Further more, the MD simulations give per- atom description of the processes that occur in SecA thus, allowing an easy manipulation of the structure (such are ligand removal or binding, mutations etc.) which could cover many questions that remained open after the experimental studies. Another reason for employing the MD simulations is that the computational studies of the SecA were rarely performed. Moreover, this thesis 5brought the first publication about the SecA that was solely based on computations or, to be more precise, on MD simulation to our knowledge. MD simulations were the key asset in this thesis and they were performed on the SecA originating from three different organisms. They were used to probe different perturbations such as mutations, nucleotide removal or signal peptide binding. The trajectories obtained by the MD simulations have been a subject of a robust analysis which yielded several very important results. A thorough analysis of the nucleotide binding pocket in the ADP-bound B. sub- tilis and T. maritima SecA led to the discovery of the water bridging of the amino acids D207 and E208, which are parts of the evolutionary conserved DEAD mo- tif (T.maritima D252/E253). This observation was experimentally confirmed in the high-resolution crystal structure of T. maritima that was published in 2015 completely independent from this research. Additionally, the dependence of water behaviour in the nucleotide binding pocket on the nucleotide binding state suggested the impor- tance of the H-bonding networking for SecA’s function. The observed complexity of the H-bonding networking, initially localized in the nucleotide binding pocket, promptly spread out to the rest of the SecA showing how extensive the H-bonding networks in a protein could be. In order to get an answer how important these net- works are, a fast and efficient way of characterizing the H-bonding networks, named H-bonding map, was developed. Indeed, H-bonding maps dissected complex hydro- gen bonding dynamics in SecA marking the SecA’s helical scaffold domain (HSD) as a central figure in already mentioned H-bonding networks. This observation led to the hypothesis that H-bonding networks play a crucial role in allosteric changes in SecA. Another important aspect in this thesis was the interaction of the SecA with other elements of the translocation machinery. Therefore, a role of the ligand presence on SecA’s dynamics was extensively studied with the special focus on the ADP and the signal peptide presence. The reasons for such peculiar interests are condensed in fol- lowing: i) ATP binding/ADP release induce conformational changes in the SecA and promote the preprotein translocation and ii) binding of the preprotein behaves as an allosteric activator of the SecA activity and prevents the uncontrolled ATP hydrol- ysis. To uncover the possible allosteric effects of the preprotein on SecA’s dynamics complex of the SecA and the preprotein’s signal sequence (SP) was simulated. The principal component analysis (PCA) was chosen to be a tool for the dissec- tion of important modes of motion and couplings established between the different functional domains of the SecA. The PCA findings were confirmed by the indepen- dent calculations of the linear mutual information (LMI), a measure of the correlation between two different atoms. These investigations indicated that a long-distance cou- pling is established between the SecA’s domains in presence of the SP. Furthermore, the regions of highly correlated residues from the different domains correspond to the results of the H-bonding maps, confirming that H-bonding networks possibly serve as the allosteric transducers. In the summary, the results obtained in this thesis led to the conclusion that instead of one specific amino acid residue serving as the catalytic base proposed by the previous experimental work, the water-bridge between two DEAD amino acid residues, D207 and E208, exists. Moreover, it was noticed that the water-bridge presence is nucleotide dependent and highly sensitive to D207N mutation, which is proven to abolish catalytic activity of SecA. H-bonding map, a novel method for visualization of the H-bonding dynamics showed complex interconnections between functional domains of SecA achieved via the H-bonds where helical scaffold domain was identified as the central part of such interactions. Finally, research was expanded to the complex relation between the SecA and SP, a short tripartite sequence which is found in the N-terminus of every preprotein and plays very important, but not fully understood role, in translocation process. The results of the analysis indicated the establishment of the long-distance coupling between different domains of SecA which seems to be achieved via already identified networks of H-bonds. Since the ATP hydrolysis is one of the most common energy sources in biological systems and signal peptides are universal segment efficiently recognized by many different proteins, these results give a possible guidelines for analysis of similar systems and problems.
SecA ATPasen ist der essentielle Teil der bakteriellen Sektretionsmaschinerie, die die Energie der ATP-Bindung und Hydrolyse nutzt, um frisch synthetisierte Proteine aus Zyklomembran herauszutransportieren. Aufgrund seiner Bedeutung wurde SecA aufs intensivste mit unterschiedliche experimentellen Methoden untersucht. Dennoch konnte bislang der exakte Mechanismus des Translokationsprozesses nicht verstanden werden. Die Translokation beinhaltet mehrere aneinander gekoppelte Faktoren und die Komplexität des Prozesses könnte die Ursache für den Mangel einer Beschreibung sein. Molekulardynamik- Simulationen (MD-Simulationen) ermöglichen es, die statis- chen Röntgenkristallstrukturen von SecA zu animieren und Informationen über die Dynamik von SecA zu liefern, und scheinen ein guter Ansatz zur Lösung des Problems zu sein. Ein weiterer Grund für die Nutzung von MD-Simulationen ist, dass nur selten Computerstudien von SecA durchgeführt wurden. Dieser Promotion entsprang eine Erstpublikation über SecA, die komplett auf MD-Simulationen basierte. Diese MD- Simulationen bilden die Basis für diese Dissertation und wurden für SecA aus drei verschiedenen Organismen durchgeführt. Es wurden verschiedene Einflüsse, wie z.B. Mutationen, Entfernung von Nukleotiden oder Signalpeptid-Bindung, getestet. Die Trajektorien, die aus MD-Simulationen stammten, wurden einer gründlichen Analyse ausgesetzt, welche mehrere wichtige Resultate zur Folge hatte. Eine sorgfältige Analyse der Nukleotidbindungsregion in B. subtilis und T. mar- itima mit gebundenem ADP führte zur Entdeckung, dass die Aminosäuren D207 und E208, beide Teil des stark konservierten DEAD-Motivs, durch Wassermoleküle miteinander verbunden sind. Unabhängig von der hier präsentierten Forschungsar- beit wurde diese Beobachtung im Jahr 2015 mit der Publikation der hoch auflösenden Kristallstruktur von T. maritima experimentell bestätigt. Ferner legte die Abhängigkeit des Verhaltens des Wassers in der Nukleotidbindungsregion vom Bindungszustands des Nukleotids Nahe, dass das H-Brückennetzwerk eine wichtige Rolle bei der Funk- tion von SecA spielt. Die beobachtete Komplexität des H-Brückennetzwerk, das sich ursprünglich in der Nukleotidbindungsregion befand, weitete sich sehr schnell auf den Rest von SecA aus und zeigte wie ausgedehnt das H-Brückennetzwerk in einem Pro- tein sein kann. Um eine Antwort dafär zu bekommen, wie wichtig diese Netzwerke sind, wurden H-Brückenkarten entwickelt, bei denen es sich um ein schnelles und ef- fizientes Mittel handelt, mit dem H-Brückennetzwerk charakterisiert werden können. H-Brückenkarten offenbaren komplexe H-Brücken-Dynamiken in SecA, welche zur An- nahme führten, dass H-Brückennetzwerke eine entscheidende Rolle bei allosterischen Änderungen in SecA spielen. Ein weiterer wichtiger Aspekt in dieser Dissertation war die Interaktion von SecA mit anderen Elementen der Translokationsmaschinerie. Die Einfluss des Vorhandenseins des Liganden auf die Dynamik von SecA wurde intensiv untersucht. Hierbei wurde besonderer Fokus auf ADP und die Präsenz des Signalpep- tids gelegt. Das Interesse für diese beiden Punkte liegt darin begründet, dass: (I) die Bindung von ATP / die Freigabe von ADP zu konformationellen Änderungen in SecA führt und die Translokation des Präkursor-Proteins unterstützt und dass (II) das Binden des Präkursor-Proteins als allosterischer Aktivator für die Aktivität von SecA fungiert und unkontrollierter ATP-Hydrolyse vorbeugt. Um mögliche allosterische Ef- fekte des Präkursor-Proteins auf die Dynamik von SecA aufzuzeigen, wurde eine Kom- plex bestehend aus SecA und Präkursor-Protein simuliert. Hauptkomponentenanal- yse, engl. principal component analysis (PCA), wurde als Werkzeug gewählt, um ein- erseits die wichtigsten Moden der Bewegung unter verschiedenen Konditionen und an- dererseits die Kupplung zwischen unterschiedlichen funktionellen Proteindomänen in SecA zu identifizieren. Die Resultate der PCA wurden durch unabhängige Berechnun- gen der linearen gegenseitigen Information, engl. linear mutual information (LMI) un- terstützt. LMI misst die Korrelation zwischen zwei verschiedenen Atomen. Diese bei- den Untersuchungen, PCA und LMI, deuteten darauf hin, dass bei Vorhandensein von Signalpeptiden die Kopplung der Domänen von SecA über gro ̈sse Distanzen möglich ist. Die Regionen stark korrelierter Aminosäurereste von unterschiedlichen Domä- nen stimmen mit den Ergebnissen der H-Brückenkarten äberein und bestätigen, dass H-Brückennetzwerke mäglicherweise als allosterische Umwandler fungieren. Zusam- menfassend lässt sich sagen, dass die in dieser Doktorarbeit vorgestellten Ergebnisse zu dem Schluss führten, dass entgegen dem Vorschlag vorangegangener Experimente nicht ein spezifischer Aminosäurerest als katalytische Grundlage dient, sondern eine Wasserbrücke zwischen zwei DEAD-Aminosäuren, D207 und E208, vorhanden ist. Ferner wurde festgestellt, dass die Präsenz von Wasserbrücken abhängig vom Nuk- leotid ist und sehr empfindlich auf die Mutation D207N reagiert, die zur Einstel- lung der katalytischen Aktivität von SecA führt. H-Brückenkarten, ein neues Mittel zur Visualisierung von H-Bräckendynamik, zeigen komplexe Verbindungen zwischen funktionellen Domänen von SecA, die über H-Brücken ermöglicht werden bei denen die helical scaffold-Domäne eine zentrale Rolle spielt. Im letzten Schritt wurde die Forschungsarbeit auf die komplexe Beziehung zwischen SecA und Signalpeptid aus- geweitet. Das Signalpeptid ist ein eine kurze dreiteilige Sequenz von Aminosäuren, die im N-Terminus jedes Präkursor-Proteins zu finden ist und eine sehr wichtige, wenn auch nicht vollständig verstandene Rolle beim Translokationprozess spielt. Die Ergeb- nisse der Analyse weisen auf die Bildung von Kopplungen zwischen unterschiedlichen Domänen von SecA über weite Distanzen hin. Diese Kopplungen scheinen über bere- its identifizierte H-Brückennetzwerke realisiert zu werden. In dieser Dissertation wird ein möglicher Leitfaden zur Analyse ähnlicher Systeme und Probleme präsentiert, da ATP-Hydrolyse eine der häufigsten Energiequellen biologischer System ist und es sich bei Signalpeptiden um universelle Segmente handelt, die von vielen verschiedenen Proteinen erkannt werden.
