The transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) ion channel is a nonselective cation channel and osmosensor, which is permeable to calcium in response to various stimuli like moderate heat, hypotonicity, shear stress and pharmacological agonists like GSK1016790A. The functional expression of TRPV4 has already been validated in two out of three cellular layers of the cornea of the human eye, namely the corneal epithelium and endothelium. However, TRPV4 has not yet been investigated in the dominating cells of the corneal stroma, including the human corneal keratocytes (HCK). These cells contribute to the functionality of the cornea and play an important role in corneal wound healing. This Ca2+-dependent process has to take place in an orderly manner, which is not least important for haze-free regeneration after ophthalmological surgical procedures or after keratitis. TRPV4 may have a great influence on Ca2+ regulation in HCK, and it therefore may also be involved in the complex process of stromal wound healing. Therefore, the aim of this thesis was to characterize the functional expression of TRPV4 channels in HCK using different activation mechanisms. For this purpose, a SV40-induced immortalized permanent cell line of HCK was used as an in vitro cell model for stromal keratocytes. Fluorescence calcium imaging was used to measure intracellular calcium during the experiments. In addition, the classical and planar patch-clamp techniques were used to measure whole-cell currents. Extracellular application of the specific TRPV4 agonist GSK1016790A (5 μmol/l) led to an increase of the fluorescence ratio f340/f380, which is proportional to the intracellular calcium concentration ([Ca2+]i). In addition, in- and outward whole-cell currents were also increased in the presence of GSK1016790A (10 μmol/l). Furthermore, two other TRPV4 activation mechanisms, namely hypotonic challenge as well as moderate heat (28°C – 34°C), led to similar effects in comparison with the pharmacological approach. The specific TRPV4 antagonist GSK2193874 (10 μmol/l) was able to suppress the GSK1016790A and hypotonicity induced calcium increase in HCK. Moreover, classical patch-clamp recordings revealed a chloride conductivity of HCK, since the negative reversal potential became more positive when sodium chloride was replaced by sodium gluconate in the extracellular measuring solution. In conclusion, the results of this study demonstrate the functional expression of TRPV4 in HCK for the first time.
Der Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) Ionenkanal ist ein nichtselektiver Kationenkanal und Osmosensor, der als Reaktion auf verschiedene Stimuli wie moderate Hitze, Hypotonie, Scherstress und pharmakologischen Agonisten wie GSK1016790A für Kalzium permeabel ist. Die funktionelle Expression von TRPV4 konnte bereits in zwei von drei Zellschichten der Hornhaut des menschlichen Auges nachgewiesen werden, und zwar im Hornhautepithel und -endothel, jedoch noch nicht in den dominierenden Zellen des Hornhautstromas einschließlich der humanen Hornhautkeratozyten (HCK). Diese tragen zur Funktionalität der Hornhaut bei und spielen in der kornealen Wundheilung eine wichtige Rolle. Dass dieser calciumabhängige Prozess in geordneter Art und Weise abläuft, ist nicht zuletzt wichtig für eine trübungsfreie Regeneration nach ophthalmologischen operativen Eingriffen oder nach Keratitiden. Die TRPV4-Kanäle haben vermutlich einen großen Einfluss auf die Calciumregulierung in HCK und sind daher möglicherweise auch im komplexen Prozess der stromalen Wundheilung involviert. Das Ziel dieser Arbeit war daher die funktionelle Expression von TRPV4-Kanälen über verschiedene Aktivierungsmechanismen in HCK näher zu charakterisieren. Zu diesem Zweck wurde eine SV40-induziert immortalisierte permanente HCK-Zelllinie als in vitro Zellmodell für stromale Keratozyten verwendet. Über das Fluoreszenz-Kalzium-Imaging wurde die intrazelluläre Kalziumkonzentration während der Versuche gemessen. Zusätzlich wurde die klassische und die planare Patch-Clamp Technik zur Messung von Ganzzellströmen verwendet. Die extrazelluläre Zugabe des spezifischen TRPV4-Agonisten GSK1016790A (5 μmol/l) führte zu einem Anstieg des Fluoreszenzverhältnisses f340/f380, welches proportional zur intrazellulären Kalziumkonzentration ([Ca2+]i) ist. Die ein- und auswärtsgerichteten Ganzzellströme erhöhten sich ebenfalls in Gegenwart von GSK1016790A (10 μmol/l). Zwei weitere TRPV4 Aktivierungsmechanismen, wie hypotoner Stress und moderate Hitze (28°C – 34°C) führten zu ähnlichen Effekten wie im pharmakologischen Ansatz. Der spezifische TRPV4-Antagonist GSK2193874 (10 μmol/l) war in der Lage, den durch GSK1016790A und Hypotonie induzierten Calciumanstieg in HCK zu unterdrücken. Darüber hinaus zeigten klassische Patch-Clamp Messungen eine Chloridleitfähigkeit von HCK, da das negative Umkehrpotential nach Ersetzen von Natriumchlorid durch Natriumgluconat in der extrazellulären Messlösung positiver wurde. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse dieser Studie erstmals eine funktionelle Expression von TRPV4 in HCK demonstrieren.
