INTRODUCTION: Uveal (choroid) melanomas (UM) are the most common intraocular malignancy in adults. Despite successful local therapy, the prognosis remains poor due to high rates of metastasis. So far, there is no effective systemic therapeutic approach available. Tumour progression is associated with a shift towards higher concentrations of proangiogenetic growth factors like vascular endothelial growth factor (VEGF) and fibroblast growth factor 2 (FGF-2). Upregulation of VEGF was shown to be related to an increased metastatic tumour state. Cell survival, apoptosis and proliferation are regulated by a variety of pathways that include calcium-dependent mechanisms. Changes in functional expression of transient receptor potential channel (TRPs) for different primary malignancies were demonstrated using in vitro electrophysiological methods such as patch-clamp and fluorescence-calcium-imaging. TRPs are mostly permeable for calcium and involved in intracellular calcium homeostasis integrating different kinds of stimuli. AIM OF THE STUDY: Mergler et al. found increased TRPM8 expression in different UM cell lines compared to healthy uveal tissue (choroid). Based on these findings, this study aimed to investigate the expression of TRPV4 in UM and a possible crosstalk between growth factors like VEGF and FGF-2 with TRPs. METHODS: Recordings were performed using the established UM cell line 92.1. Recordings were made using fluorescence calcium-imaging and the planar patch-clamp-technique. For statistical analysis SigmaPlot und GraphPadPrism software were used. RESULTS: Extracellular application of the selective TRPV4 channel agonist GSK 1016790A (10 µM) increased the fluorescence ratio f340/f380, which is proportional to the intracellular Calcium concentration ([Ca2+]i). Furthermore, whole-cell currents were increased. This effect was blocked by the selective TRPV4 antagonist GSK 2193874 (10 µM). Extracelullar application of FGF-2 (10 ng/ml) or VEGF (20 ng/ml) led to increased [Ca2+]I and whole-cell currents, which were inhibited by the TRP Vanilloid 1 (TRPV1) blocker capsazepin. The FGF-2-induced responses were blocked by GSK 2193874 whereas the VEGF-induced responses remained unchanged. Finally, an inhibitory effect on TRPV1 activity was shown by TRPM8 activation: The effect of extracellular application of VEGF was supressed in presence of the thyroid hormone derivate 3-Iodothyronamin (T1AM), which is described as a TRPM8 modulator. CONCLUSION: For the first time, functional expression of TRPV4 in UM was shown. The function and role in tumour progression of TRPV4 remains to be elucidated. The crosstalk between TRPV1 und TRPM8 is interesting regarding the development of targeted therapies since functional expression of TRPM8 is at higher levels in UM. Therefore, the use of targeted TRPM8 medication affecting only malignant cells may be conceivable while healthy cells would be rather spared. LIMITATIONS: Although currently, such a therapeutic option appear speculative, systematic investigations on models that have yet to be established are the basis of any progress in this area. This dissertation hopes to contribute to this daunting task.
EINLEITUNG: Das uveale Melanom (UM) oder Aderhautmelanom ist der häufigste intraokulare Tumor im Erwachsenenalter. Trotz erfolgreicher Lokaltherapie ist die Prognose aufgrund der hohen Metastasierungsrate ungünstig. Eine erfolgreiche systemische Therapie konnte bisher nicht etabliert werden. Mit der Tumorprogression wird eine Verschiebung der Homöostase zugunsten proangiogenetischer Faktoren, wie vascular endothelial growth factor (VEGF) und fibroblast growth factor 2 (FGF-2) diskutiert. Erhöhte VEGF Konzentrationen konnten mit erhöhter Metastasierungsrate assoziiert werden. Zellüberleben, Apoptose und Wachstum sind unter anderem calciumabhängig reguliert. Mittels in vitro elektrophysiologischen Methoden wie Patch-Clamp und Fluoreszenz-Calcium-Imaging wurden in verschiedenen Primärtumoren funktionelle Veränderungen in der transient rezeptor potential (TRP) - Kanalexpression nachgewiesen. TRP-Kanäle sind zumeist calciumpermeabel und an der Calciumhomöostase beteiligt. Dabei integrieren sie eine Vielzahl verschiedenartiger Stimuli. FRAGESTELLUNG: Mergler et al. konnten zeigen, dass sich in mehreren UM Zelllinien im Gegensatz zur gesunden humanen Uvea (Aderhaut) eine erhöhte funktionelle TRP melastatin 8 (TRPM8) Kanalexpression andeutet. In dieser Arbeit wurde hierauf basierend untersucht, ob der TRP vanilloid 4 (TRPV4)-Kanal ebenfalls funktionell in den Zellen einer UM-Zelllinie exprimiert ist und ob eine Interaktion zwischen den Wachstumsfaktoren VEGF bzw. FGF-2 und den TRP Kanälen existiert. METHODEN: Die Untersuchungen wurden an der etablierten UM-Zelllinie 92.1 durchgeführt. Messungen erfolgten mittels Fluoreszenz Calcium-Imaging und mittels planarer PatchClamp-Technik. Die statistische Auswertung erfolgte mittels SigmaPlot und GraphPadPrism Software. ERGEBNISSE: Extrazelluläre Applikation des hochspezifischen TRPV4 Agonisten GSK 101679A (10 µM) erhöhte den Fluoreszenzquotienten f340/f380, welcher proportional zur intrazellulären Calciumkonzentration ([Ca2+]i) ist. Außerdem erhöhten sich die Ganzzellströme. Dieser Effekt konnte durch den spezifischen TRPV4 Blocker GSK 2193874 (10 µM) unterdrückt werden. Die extrazelluläre Applikation von FGF-2 (10 ng/ml) oder VEGF (20 ng/ml) führte zu einer Erhöhung der [Ca2+]i und der Ganzzellströme. Beide Effekte konnten durch den TRP vanilloid 1 (TRPV1) Antagonisten Capsazepin (CPZ) unterdrückt werden. Die FGF-2 induzierten Stromantworten konnten zusätzlich durch GSK 2193874 unterdrückt werden, die VEGF induzierten nicht. Schließlich wurde eine Inhibition der TRPV1 Kanäle durch TRPM8 Aktivierung nachgewiesen: Die durch extrazelluläre Applikation von VEGF induzierte Calciumantwort konnte in Gegenwart des Schilddrüsenhormonderivats 3-Iodothyronamin (T1AM) unterdrückt werden, welches als TRPM8 Modulator gilt. SCHLUSSFOLGERUNG: Eine funktionelle TRPV4 Expression in UM konnte erstmalig gezeigt werden. Die Funktion und Beteiligung von TRPV4 an der Tumorprogression bleibt in Folgearbeiten zu evaluieren. Die Wechselwirkung zwischen TRPV1 und TRPM8 ist im Hinblick auf die Entwicklung spezifischer Tumortherapien interessant, da im Gegensatz zu TRPV1 im UM eine erhöhte Expression von TRPM8 vorliegt. Somit wäre eine zielgerichtete Medikation an entarteten Zellen mit TRPM8 Expression denkbar, wobei gesunde Zellen eher verschont würden. Ein Ausfall der Wirkungen des TRPM8 auf die Kältewahrnehmung dürfte in Anbetracht der Schwere des UM dabei eher gut zu verkraften sein. LIMITATIONEN: Voraussetzung für solche derzeit eher spekulativ anzusehenden Einsatzgebiete ist allerdings die systematische Erforschung an Modellen, die teilweise erst etabliert werden müssen. Zu dieser wichtigen Aufgabe soll diese Arbeit einen Beitrag leisten.
