Die zentrale Fragestellung dieser Arbeit war, inwiefern liposomale Konjugate mit ApoE-abgeleiteten Peptiden als potentielles Drug Delivery-System einen LDL-Rezeptor-vermittelten Transport an der Blut-Hirn-Schranke induzieren und damit zur Verbesserung des Arzneistofftransportes ins ZNS genutzt werden können. Schwerpunkte lagen zum einen auf der Herstellung und Charakterisierung von Liposomen mit sowohl adsorptiv als auch kovalent gebundenen ApoE-Peptiden und zum anderen auf der Untersuchung der Interaktion dieser Konjugate mit Endothelzellen von Hirnkapillaren.
Neben der kovalenten Kopplung des Tandemdimers der Aminosäuresequenz 141 - 150 aus der LDL-Rezeptor-Bindungsdomäne von ApoE (A2) an sterisch stabilisierte Liposomen gelang es, ApoE-Peptid-Liposomen durch adsorptive Bindung herzustellen. Durch Modifizierung des A2-Peptides mit lipidbindenden Peptidsequenzen und Acylketten konnte das Tandemdimer stabil in der Liposomenbilayer verankert werden. Hierbei erwies sich das dipalmitylierte ApoE-Peptid als am geeignetsten, da es eine effiziente Verankerung ohne Störung der Integrität der Liposomen gewährleistete. Strukturuntersuchungen bestätigten die Induktion einer a-helikalen Konformation der ApoE-Peptide bei Bindung an Liposomen als Voraussetzung für die LDL-Rezeptor-Erkennung. Mit der Charakterisierung der LDL-Rezeptor-Expression von verschiedenen primären und immortalisierten Gehirnkapillarendothelzellen und dem Nachweis einer insgesamt moderaten Zytotoxizität der ApoE-Peptid-Liposomen wurden die Voraussetzung für Aufnahmeuntersuchungen und mechanistische Studien geschaffen.
Es wurde bestätigt, dass die A2-Sequenz an den LDL-Rezeptor bindet. Die Affinität war jedoch ca. um den Faktor 1000 geringer verglichen mit dem natürlichen Liganden LDL. Dennoch vermittelten die ApoE-Peptide eine effektive Aufnahme der Liposomen in Gehirnkapillarendothelzellen. Untersuchungen zum Internalisierungsmechanismus an Fibroblasten mit hoch- und runterregulierter LDL-Rezeptor-Expression und in Gegenwart eines LDL-Rezeptor-Antikörpers zeigten, dass unspezifische Aufnahmeprozesse überwogen. Das Heparansulfat- Proteoglykan-Gerüst (HSPG) der Zellmembran wurde dabei als eine wichtige Komponente für die Internalisierung der ApoE-Peptid-Liposomen identifiziert. Strukturelle Ähnlichkeiten der kationischen ApoE-Peptide mit der Klasse der zellpenetrierenden Peptide lassen darüber hinaus erwarten, dass neben dem HSPG-vermittelten Aufnahmeprozess noch weitere, bisher wenig charakterisierte Translokationsmechanismen von Bedeutung sein könnten.
Obwohl keine LDL-Rezeptor-vermittelte Anreicherung der Liposomen in Gehirnkapillarendothelzellen nachgewiesen werden konnte, zeigen diese Untersuchungen, dass auch HSPG-vermittelte Prozesse für eine Verbesserung des Wirkstofftransportes über die BHS nutzbar gemacht werden können. Die Bedeutung der kationischen ApoE-Peptide liegt dabei insbesondere in ihrer großen Translokationseffizienz und der Fähigkeit, den Transport von makromolekularen Strukturen, z.B. Liposomen, in Gehirnkapillarendothelzellen zu vermitteln. Die erfolgreiche Umsetzung des Konzeptes der adsorptiven Peptidbindung an Liposomen ermöglicht darüber hinaus eine schnelle und effektive Herstellung derartiger Komplexe. Die gefundenen Parameter zur Herstellung adsorptiver Komplexe mit Liposomen sind auf andere Vektoren übertragbar und können somit für weitere Targets nutzbar gemacht werden.
A promising strategy to tackle the problem of insufficient drug transport across the blood-brain barrier (BBB) is the use of drug delivery systems consisting of colloidal drug carriers and targeting- and uptake-facilitating ligands. The aim of this work was to assess whether liposomes bearing a peptide derived from the LDL receptor-binding domain of Apolipoprotein E (ApoE) can mimic the functional principles of lipoproteins and initiate an endocytotic uptake into endothelial cells of brain microvessels and furthermore a transport across the BBB. Major aspects of this work were the preparation and characterization of liposomes with adsorptively as well as covalently coupled ApoE peptides and the investigation of liposome interactions with endothelial cells of brain microvessels with emphasis on specific interactions with the LDL receptor.
ApoE peptide-liposomes were prepared of POPC vesicles and two-domain peptides encompassing the highly cationic tandem dimer peptide (141-150)2 derived from the receptor-binding domain of ApoE and various lipid-associating domains, such as amphipathic or transmembrane helices or fatty acid chains.
Peptide interactions with liposomes were investigated in terms of lipid affinity, structure and membrane-disturbing activity, and the complexes were characterized with respect to size and stability. A dipalmitylated tandem dimer peptide seemed to be the most promising candidate for the functionalization of liposomes since it showed a stable anchoring, a low membrane-disturbing activity and a pronounced helical conformation as a prerequisite for LDL receptor recognition. Furthermore, covalent coupling of a thiol-modified tandem dimer peptide (141-150)2 onto the distal ends of polyethylene glycol (PEG) chains of sterically stabilized liposomes provided highly stable complexes.
All peptide-liposome complexes showed moderate cytotoxicity in various types of brain microvessel endothelial cells, which were characterized regarding their LDL receptor expression level. LDL receptor binding of the tandem dimer peptide was demonstrated in competition binding experiments. Although the receptor affinity was reduced by a factor of 1000 compared to the natural ligand LDL, the peptide mediated an effective endocytotic, energy-dependent uptake of liposomes into the cytoplasm of brain microvessel endothelial cells. Low peptide affinity to the LDL receptor and liposome internalization into fibroblasts with up- and down-regulated receptor level as well as into cells incubated with an antibody against the LDL receptor pointed to a dominating role of LDL receptor-independent transport routes. Enzymatic digestion of heparan sulfate proteoglycan (HSPG) with heparinase I and addition of heparin and poly-L-lysin as competitors of HSPG and HSPG-ligands, respectively, resulted in a significant loss in liposome uptake. The results suggested that the ubiquitously expressed cell matrix component HSPG played a decisive role in the ApoE peptide-mediated internalization of liposomes. Due to the high positive charge of the ApoE peptides other unspecific transport mechanisms as discussed for cell-penetrating peptides might be involved as well.
In conclusion, efficient uptake via cell surface HSPG may provide a promising strategy for facilitated drug delivery across the BBB. Although the ApoE- derived sequence did not activate a specific LDL receptor-dependent transport route, the observed internalization was very efficient and emphasized the potential of cationic peptides as ligands for drug delivery. Adsorptive complexing of uptake-facilitating ligands to liposomes provides an easy and efficient method for the generation of drug delivery systems and is useful for various targeting strategies.
