Innerhalb dieser Doktorarbeit wurden verschiedene Aspekte der Analyse komplexer Genome untersucht. Zunächst wurde die Anwendbarkeit verschiedener, auf Hybridisierung beruhender Techniken für das genetische Kartieren in den Genomen von Zebra- und Medakafisch getestet. Diese sollten ein effizientes Kartieren mit einer hohen genetischen Auflösung erlauben. Die einfachste Möglichkeit Marker zu generieren, die durch Hybridisierung kartiert werden können, ist die IRS-PCR. Diese PCR-Technik nutzt die im Genom eingestreuten repetitiven Elemente aus, um die nicht repetitive Frakton des Genoms zu amplifizieren, die zwischen zwei dieser Elemente liegt. Dieses komplexe PCR- Produkt wurde kloniert und etwa 1000 individuelle Klone einer rund 16.000 Klone umfassenden Marker-Bibliothek wurden auf kleine ´Southern´-blots hybridisiert, die IRS-PCR-Produkte verschiedener Zebrafischstämme enthielten. Die Klone, die auf den Southernblots einen +/- -Polymorphismus zeigten, wurden anschließend auf "Kartierungsfilter" hybridisiert, die IRS-PCR-Produkte von vier verschiedenen Kreuzungen enthielten. Bei dieser Vorgehensweise traten zwei Schwierigkeiten auf: Zum einen wurden aufgrund einer gewissen Redundanz der Marker-Bank wiederholt die gleichen Klone analysiert. Dieses Problem konnte teilweise gelöst werden, indem die gesamten Marker-Bank durch ´Oligo- fingerprinting´ analysiert wurde, und Klone mit ähnlichen ´fingerprints´ in Clustern zusammengefaßt, und dann repräsentative Klone verschiedener Cluster untersucht wurden. Das größere Problem war jedoch der hohe Grad an Variabilität innerhalb der Zebrafisch-Stämme, so daß schließlich nur 30% der Marker, die zuvor als polymorph identifiziert wurden, auf der Karte plaziert werden konnten. Insgesamt konnten aber dennoch rund 80 verschiedene Marker auf einer der Referenz-Kreuzungen ausgewertet werden, und 50 davon zeigten genetische Kopplung zu wenigstens einem weiteren Marker. Im Medakafisch wurde diese Strategie ebenfalls, jedoch mit einer Kombination von Primern, die für drei verschiedene repetitive Elemente komplementär sind, getestet. Aus der 3800 Klone umfassenden Marker-Bank wurden hundert potentielle Marker auf Southern blots getestet. Die Rate an polymorphen Markern lag mit 30 % mehr als doppelt so hoch wie im Zebrafisch. Darüber hinaus waren 50 % der als polymorph identifizierten Marker auch auf einer F2-Kreuzung zweier verschiedener Populationen polymorph. Dies zeigt, daß im Medakafisch die Stämme genetisch gut getrennt und innerhalb eines Stammes relativ homozygot sind. Um weitere genetische Marker zu finden, die außerdem eine gleichzeitige Verknüpfung von genetischen Kartierungsdaten und genomischen Klonen erlaubten, wurde für den Medakafisch eine modifizierte AFLP-Methode entwickelt. Nach Hybridisierung von Amplikons, die aus zwei verschiedenen Medakafischstämmen generiert wurden, auf eine Cosmid-Bank, wurden 80 Klone isoliert, die ein differentielles Hybridisierungsmuster aufwiesen. Aus 20 % der so identifizierten Cosmide ließ sich eine Probe isolieren, die sich auf einer F2-Geschwister-Kreuzung kartieren ließ. Ein weiterer Aspekt bei der Untersuchung komplexer Genome ist die vergleichende Sequenzanalyse. Dadurch können Einblicke in Genomevolution und -organisation gewonnen werden. Innerhalb dieser Arbeit wurde ein 40 kb großer Klon aus einer Amphioxus-Cosmid-Bank sequenziert, mit verschiedenen Exon-Vorhersage-Programmen (Grail, GenScan, Mzef) untersucht und mit zwei öffentlichen (Genbank, Swissprot) und einer internen (Amphioxus-EST) Sequenzdatenbanken verglichen. Dabei konnte unter anderem ein Gen der Aldo- Keto-Reduktase-Familie identifiziert werden. Es konnte ferner gezeigt werden, daß sich genomische Sequenzanalyse und EST-Projekte komplementieren.
During the work for this thesis several aspects of the analysis of complex genomes were explored. Firstly, the applicability of different hybridisation based approaches for genetic mapping was tested in the genomes of zebrafish and medakafish. Such approaches should allow efficient mapping of new markers to a high resolution. IRS-PCR is the simplest possibility to generate markers that can be mapped by hybridisation. It takes advantage of interspersed repetitive sequences in the genome to amplify a set of unique DNAs between two of such elements. The PCR-products were cloned and more than 1000 individual clones of a 16 thousand clone containing marker library were tested for polymorphism on small southern blots of complex IRS-PCR product of different Zebrafisch strains. The markers identified polymorphic were subsequently hybridised on mapping filters onto which IRS-PCR-products of individuals of four different mapping crosses were spotted. Two major difficulties were found with this approach: Because of the redundancy of the library clones were tested repeatedly. This problem could be overcome by analysing the whole marker library by oligo-fingerprinting and grouping the clones with similar fingerprints in clusters. Representatives of different clusters were then used as hybridisation probes and sequenced. The major problem, however, was the high degree of variability within the zebrafish strains. Because of this less than 10 % of the markers that were identified polymorphic on Southern blots were informative on a reference cross and could be placed on a map. Despite of the encountered problems around 80 markers could be scored on one of the reference crosses, and 50 of those showed linkage to at least one further clone. The size of the genetic map of the Zebrafish estimated from these experiments is around 2700 cM and thus very close to the size determined from other laboratories (2635 cM). The same strategy was also tested for the Medakafish, however with a combination of primers, specific for three different repetitive elements. From the 3800 clone medaka library hundred clones were tested on Southern blots. The rate of polymorphic markers was almost 30% and compared to the zebra fish more than twice as high. Moreover 15 % of the makers previously identified polymorphic were informative on an F2-intercross of different strains. This indicates a much higher genetic distance between the different strains than in the Zebrafish. In order to generate further markers that could simultaneously be linked to genomic clones a modified AFLP-technique was developed. After differential hybridisation of two amplicons generated from different strains on a cosmid library 80 clones with a differential hybridisation pattern could be identified. It was possible to isolate a probe from 20 % of the cosmids, and more than 50% could be mapped on a F2-intercross. A further aspect of the analysis of complex genomes is the comparative sequence analysis. By comparison of genomic sequences of different species it is possible to get insights into gemone evolution and -organisation. Within this work a 40 kb clone of an amphioxus cosmid-library was sequenced, analysed with different exon prediction programs and the deduced protein sequence was compared with two public and one in house sequence database. This has led to the identification of a gene of the aldo- keto reductase family as well as further exons which gave a significant database match to known genes. Furthermore it could be demonstrated that genomic sequence analysis and EST projects complement each other well.
