Das Medulloblastom (MB) ist ein hochmaligner embryonaler Tumor des zentralen Nervensystems und stellt den häufigsten malignen Hirntumor im Kindesalter dar. Sowohl morphologisch als auch molekulargenetisch kann das Medulloblastom in verschiedene Subgruppen unterteilt werden. Eine dieser Untergruppen, die sogenannten Wnt-Medulloblastome, ist durch eine pathologische Aktivierung des Wnt-Signalwegs charakterisiert. Dieser Wnt-Entwicklungskontrollsignalweg ist u.a. für die Embryogenese des Kleinhirns essentiell und kann bei pathologischer Aktivierung die Entstehung verschiedener epithelialer, mesenchymaler und neuraler Tumore auslösen. Das Wilms Tumorsuppressorgen WTX kodiert für eine wesentliche, negativ regulierende Komponente dieses Entwicklungskontrollsignalwegs. Ziel dieser Arbeit war es nachzuweisen, ob sich in Medulloblastomen genetische Veränderungen wie somatische Mutationen oder Expressionsunterschiede im Wilms Tumorsuppressorgen detektieren lassen, die möglicherweise für die pathologische Wnt-Aktivierung im Medulloblastom verantwortlich sind. Mit Hilfe der Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus- (SSCP) und Sequenzierungs-Analyse konnten in einem Kollektiv von 67 humanen Medulloblastomen und 5 Medulloblastomzelllinien in 3 Proben somatische Mutationen im WTX-Gen nachgewiesen werden, die größtenteils zu einer pathologischen Aktivierung des Wnt-Signalwegs führen, was die funktionelle Relevanz dieser somatischen Mutationen untermauert. Zum Nachweis einer möglichen Regulierung von WTX im Medulloblastom wurde eine quantitative Genexpressionsanalyse von WTX in 43 MB sowie 5 MB Zelllinien durchgeführt. Im Vergleich zu adultem Kleinhirngewebe konnte in Medulloblastomen eine signifikante WTX-Überexpression beobachtet werden. Interessanterweise zeigte sich die WTX-Expression im Medulloblastom verglichen mit fetalem Kleinhirngewebe vermindert; dies könnte auf eine mögliche Beteiligung von WTX innerhalb der Entwicklung des Kleinhirns hinweisen. Weitere Expressionsanalysen an fetalen und postnatalen Kleinhirnproben unterschiedlichen Alters sowie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungen an murinem Kleinhirn unterschiedlicher Entwicklungsstadien belegten die Regulation von WTX während der Kleinhirnentwicklung und somit auch den Einfluss des Wnt- Signalwegs auf die zerebelläre Genese. Anhand von Wnt- aktivierten/-inaktivierten humanen Tumorzelllinien konnte darüber hinaus funktionell nachgewiesen werden, dass die Expression von WTX mit der Wnt- Aktivität korreliert. So kann Wtx als indirekter Marker für den Wnt- Aktivitätszustand in der Tumorzelle betrachtet werden. Zusammenfassend konnten in Medulloblastomen somatische WTX-Mutationen detektiert werden, die zu einer funktionellen Aktivierung des Wnt-Signalwegs im Medulloblastom führen. Die gesteigerte WTX-Expression in fetalem Kleinhirngewebe sowie in Wnt-aktiven Zellen unterstreicht WTX als indirekten Marker der Wnt-Aktivität während der zerebellären Genese und in Tumorzellen. Postnatal konnte die WTX-Expression bzw. die Wnt-Aktivität einer spezifischen Phase des sich entwickelnden Kleinhirns zugeordnet werden. Entgegen vereinzelter Studien, ist das WTX/Wnt- Signal nicht nur auf die Purkinjezellen der ventrikulären Zone beschränkt, sondern auch in granulären Zellen mit Ursprung der rhombischen Lippe, einem gemutmaßtem Zentrum der Medulloblastom-Entstehung, zu detektieren.
Medulloblastoma (MB) represents the most frequent malignant brain tumor of childhood. It is morphologically and moleculargenetically divided into different subgroups. One of them, the so-called Wnt group is characterized by a pathological activation of the Wnt signaling pathway. The Wnt pathway controls development and is essential in the cerebellar embryogenesis. Its pathological activation can cause diverse epithelial, mesenchymal and neural tumors. Previous genetic studies in MBs have identified mutations in genes coding for β-CATENIN, AXIN1 and CONDUCTIN (AXIN2), which cause activation of the Wnt signaling pathway in about 10 to 15% of medulloblastoma. The Wnt signaling pathway is negatively controlled by the Wilms tumor suppressor gene WTX, a component of this signaling complex. The aim of this study was to investigate genetic alteration in Wilms Tumor Suppressor Gene which could activate the Wnt signaling pathway pathologically. A mutational screening of the WTX gene in 67 MB biopsy samples and 5 MB cell lines using single-strand conformation polymorphism and sequencing analysis should illuminate whether alterations in WTX may also be involved in the pathogenesis of sporadic MBs. Beside two MBs with a rare WTX single nucleotide polymorphism, three somatic mutations of the WTX gene were identified in three different MBs. Mostly, the somatic mutations shows a functional relevance by inducing the pathological activation of Wnt pathway. A quantitative expression analysis of the tumor suppressor WTX in 43 MBs and 5 MB cell lines was initially performed to clarify a possible regulation of WTX expression in medulloblastoma. Apart from a few expression alterations of WTX in between the MB, the analysis revealed significant over-expression of WTX mRNA in MB compared to adult cerebellar tissue. Interestingly, when compared to fetal cerebellar tissue of different embryonic ages, WTX is down-regulated in medulloblastoma. These results could indicate a possible involvement of WTX during cerebellar development. Further postnatal expression analyses in fetal and postnatal cerebellum of different ages and fluorescence in situ hybridization of murine cerebellum substantiate the regulation of WTX in cerebellar development and, consequently, the influence of Wnt signaling pathway on the cerebellar genesis. Moreover, wild- type WTX was found to be over-expressed in tumor cell lines in which the Wnt signaling pathway is activated by mutations in β-CATENIN. Therefore the activation state of Wnt signaling in tumor cells can be defined indirectly by Wtx. Our findings indicate that a subset of MBs reveal mutations in the WTX tumor suppressor gene, which cause a functional activation of Wnt signaling. The up-regulation of WTX in fetal cerebellar tissue and in Wnt-activated tumor cells suggests that WTX could be a potential marker within tissue in which the Wnt signaling pathway is activated but WTX seems not to be a direct target gene of the Wnt pathway. The activity of WTX and Wnt could be related to a specific postnatal stage of cerebellar development. In contrary to several studies, the WTX/Wnt signal is not only restricted to the Purkinje cells of the ventricular zone, but also detectable in granular cells of the rhombic lip, a presumed pathogenetic origin of the medulloblastoma.
