Complex carbohydrates, also referred to as glycans, are ubiquitous in nature and represent one of the major classes of biopolymers. In contrast to peptides and oligonucleotides whose structure is directly related to specific genes, glycans are not directly encoded in the DNA. Instead, their structure is the result of a dynamic biosynthetic pathway that is heavily affected by environmental factors. Consequently, glycans are extremely diverse and exhibit branched sites, as well as a complex regio- and stereochemistry. A common way to address this complexity is liquid chromatography (LC) in combination with spectroscopic and mass spectrometric (MS) detection. It allows for high throughput measurements and can identify the general building block composition of a glycan, but it often fails to unambiguously assign the linkage between building blocks. The type of linkage, however, is a key factor for the three-dimensional structure of the glycan and therefore its biological functions. A promising alternative, which is sensitive to the globular structure of a glycan, is ion mobility-mass spectrometry (IM-MS). In addition to the separation based on the mass-to-charge (m/z) ratio, IM-MS allows to distinguish ions based on their size, shape, and charge. LC-MS and IM-MS both showed enormous potential for the analysis of glycans as standalone techniques, each providing a different level of information. However, there are very few examples of combining both approaches into a consistent LC-IM-MS workflow. In this thesis, it was investigated if IM-MS can be hyphenated to classical LC-MS workflows to enable a comprehensive structural elucidation of complex N-glycans. As sample preparation for LC-MS usually includes the modification of the reducing end of the glycan, the first step was to study the effect of these derivatizations on the quality of IMS separation. The problem was addressed by the systematic study of a set of six isomeric fucose-containing blood group antigens that are derivatized with the most common fluorescent tags using IMS. The quality of the separation was evaluated by comparing the CCS values of all species in positive and negative ion mode as well as with adduct ions. Afterwards, the application of LC-IMS-MS for the investigation of complex N-glycans was demonstrated. For this purpose, the glycans from human alpha-1-acid glycoprotein (hAGP) were investigated to identify the sialylation (α2,3- vs α2,6-linked residues) and fucosylation (core vs terminal) patterns. It was shown that IMS enables the structural elucidation of even highly sialylated glycans up to tetraantennary species without changing the sample preparation and within a single LC run. The main parameters that are obtained from LC-IMS-MS measurements are retention times, mass-to-charge-ratios, and drift times, which represent a powerful dataset to identify glycan isomers. However, retention times in LC and drift times in IMS depend significantly on instrumental parameters and are difficult to compare between experiments. We therefore introduced an internal calibration method for the conversion of retention times into universal glucose units (GU) and drift times into collisional cross-sections (CCS). It was shown that the internal calibration approach enabled a faster, more accurate analysis for both LC and IMS without loss in calibration accuracy or informational content. Overall, the addition of IMS into classical LC-MS workflows is straightforward and only requires minor adaptions in sample preparation and data treatment. It enables a fast and accurate identification of structural motifs and complements the informational content of LC-MS experiments. LC-IM-MS therefore represents a powerful combinational approach for the comprehensive analysis of complex N-glycans.
Komplexe Kohlenhydrate, auch als Glykane bezeichnet, sind in der Natur allgegenwärtig und stellen eine der Hauptklassen von Biopolymeren dar. Im Gegensatz zu Peptiden und Oligonukleotiden, deren Struktur in direktem Zusammenhang mit bestimmten Genen steht, sind Glykane nicht direkt in der DNA kodiert. Stattdessen ist ihre Struktur das Ergebnis einer dynamischen und komplexen Biosynthese, der stark von Umweltfaktoren beeinflusst wird. Folglich sind Glykane äußerst vielfältig und weisen verzweigte Stellen sowie eine komplexe Regio- und Stereochemie auf. Ein gängiger Weg, um dieser Komplexität zu begegnen, ist die Flüssigchromatographie (LC) in Kombination mit spektroskopischer und massenspektrometrischer (MS) Detektion. Es ermöglicht Messungen mit hohem Durchsatz und kann die allgemeine Zusammensetzung eines Glykans identifizieren, kann jedoch häufig die Verknüpfung zwischen Bausteinen nicht eindeutig zuordnen. Die Art der Verknüpfung ist jedoch ein Schlüsselfaktor für die dreidimensionale Struktur eines Glykans und damit mitverantwortlich für seine biologischen Funktionen. Eine vielversprechende Alternative, die sensitiv für die globuläre Struktur eines Glykans ist, ist die Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie (IM-MS). Zusätzlich zur Trennung auf Basis des Masse-zu-Ladungsverhältnis (m/z) ermöglicht IM-MS die Unterscheidung von Ionen basierend auf ihrer Größe, Form und Ladung. LC-MS und IM-MS zeigten beide großes Potenzial für die Analyse von Glykanen als eigenständige Techniken, die jeweils eine andere Informationsebene liefern. Es gibt jedoch nur sehr wenige Beispiele für die Kombination beider Ansätze zu einem konsistenten LC-IM-MS Arbeitsablauf. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob IM-MS mit klassischen LC-MS Arbeitsabläufen verknüpft werden kann, um eine umfassende Strukturaufklärung komplexer N-Glykane zu ermöglichen. Da die Probenvorbereitung für LC-MS normalerweise die Modifikation des reduzierenden Endes am Glykan beinhaltet, bestand der erste Schritt darin, die Auswirkung dieser Derivatisierungen auf die Qualität der IMS-Trennung zu untersuchen. Das Problem wurde durch die systematische Untersuchung eines Satzes von sechs isomeren Blutgruppen Antigenen angegangen, die mit den gängigsten Fluoreszenzmarkern derivatisiert wurden und anschließend mittels IMS gemessen wurden. Die Qualität der Trennung wurde durch den Vergleich der CCS-Werte aller Spezies im positiven und negativen Ionenmodus sowie mit Addukt-Ionen bewertet. Anschließend wurde die Anwendung von LC-IMS-MS zur Untersuchung komplexer N-Glykane demonstriert. Zu diesem Zweck wurden die Glykane aus menschlichem alpha-1-acid Glykoprotein (hAGP) untersucht, um das Sialylierungs- (α2,3- vs. α2,6-Verknüpfung) und Fucosylierungsmuster (am reduzierenden Ende vs. terminal) zu identifizieren. Es konnte gezeigt werden, dass IMS die Strukturaufklärung selbst hochsialylierter Glykane bis hin zu tetraantennären Spezies ohne Änderung der Probenvorbereitung und innerhalb eines einzigen LC-Laufs ermöglicht. Die Hauptparameter, die aus LC-IMS-MS-Messungen erhalten werden, sind Retentionszeiten, Masse-zu-Ladungsverhältnisse und Driftzeiten, die eine hohe Informationsdichte zur Identifizierung von Glykanisomeren darstellen. Retentionszeiten in LC und Driftzeiten in IMS hängen jedoch erheblich von instrumentellen Parametern ab und sind zwischen Experimenten nur schwer zu vergleichen. Wir haben daher ein internes Kalibrierverfahren eingeführt, dass die Umrechnung von Retentionszeiten in universelle Glucoseeinheiten (GU) und von Driftzeiten in Kollisionsquerschnitte (CCS) ermöglicht. Es wurde gezeigt, dass dies eine schnellere und genauere Analyse sowohl für LC als auch für IMS ohne Verlust der Kalibrierungsgenauigkeit oder des Informationsgehalts ermöglicht. Insgesamt ist die Integration von IMS in klassische LC-MS-Workflows unkompliziert und erfordert nur geringfügige Anpassungen bei der Probenvorbereitung und Datenverarbeitung. Es ermöglicht eine schnelle und genaue Identifizierung von Strukturmotiven und ergänzt den Informationsgehalt von LC-MS-Experimenten. LC-IM-MS stellt daher einen leistungsstarken kombinatorischen Ansatz für die umfassende Analyse komplexer N-Glykane dar.
