In this work, immunoisolated centrosomes from Drosophila syncytial embryos were used to investigate biophysical properties of this organelle and for a proteomic analysis that facilitated the identification and functional characterization of centrosomal proteins. The functional analysis aimed at elucidating the role of identified proteins in the maintenance of centrosome integrity, maturation, duplication, separation and cell cycle progression. With regard to the centrosome’s biophysical properties, laser-based optical manipulation of individual organelles revealed the centrosome as a negatively charged protein complex and that the centrosome structure is modulated by its own electric field in a pH-dependent manner. The MS-analysis of isolated centrosomes identified 260 centrosomal candidate proteins, which were subsequently studied by RNAi in Drosophila cultured cells. Immunofluorescence microscopy and FACS was used to analyze the resulting phenotypes. A set of 11 proteins was found to be critical for centrosome structure maintenance as depletion of any of these proteins in Drosophila SL2 cells resulted in centrosome disintegration, revealing a molecular dependency of centrosome structure on components of the protein translational machinery, actin and nuclear proteins. In total, novel centrosome related functions were assigned to 27 proteins, of which 14 were confirmed in human cells via siRNA mediated depletion of homologous proteins. Furthermore, the analysis of human orthologues revealed a high level of functional conservation for proteins implicated in centrosome duplication and separation. In addition to the whole proteome analysis of the Drosophila centrosome, a second proteomic study aimed at identifying centrosomal kinase substrates and elucidating their function. By enriching phosphopeptides from centrosomal preparations prior to MS analysis, 45 phosphorylation sites, of which 17 have not been described before, were identified in 27 proteins. All MS-identified phosphoproteins were functionally characterized and integrated into regulatory signaling networks with the 3 most important mitotic kinases, cdc2, polo, aur, as well as the house keeping kinase CkIIβ. Using a combinatorial RNAi strategy, novel functions for P granule, nuclear envelope and nuclear proteins in centrosome duplication, maturation and separation were revealed. For a subset of phosphoproteins, we identified previously unknown centrosome and/or spindle localization via expression of tagged fusion proteins in cultured cells. In conclusion, this work comprises a comprehensive molecular and functional description of the Drosophila centrosome and moreover the first inventory of in vivo centrosome-specific phosphorylation residues. It thereby provides an important prerequisite for future studies to gain deeper insights into the mechanisms that underlie this organelle’s biogenesis and its diverse functions throughout the cell cycle and in cellular signaling.
In der vorliegenden Arbeit wurden immun-isolierte Zentrosomen synzytialer Drosophila-Embryonen zur Untersuchung der biophysikalischen Beschaffenheit dieses Zellorganells verwendet. Desweiteren wurde eine Proteomanalyse zur Identifizierung und funktionellen Charakterisierung zentrosomaler Proteine durchgeführt. Die funktionelle Analyse verfolgte das Ziel, die Rolle identifizierter Proteine in der Aufrechterhaltung zentrosomaler Struktur, in zentrosomaler Reifung, Verdopplung und Separation sowie Zellzyklus-Fortschritt aufzuklären. Bezüglich der biophysikalischen Eigenschaften des Zentrosoms ergab die Laser-basierte optische Manipulation einzelner Zentrosomen, dass dieser Proteinkomplex eine negative Ladung trägt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Struktur des Zentrosoms in einer pH-abhängigen Weise durch das selbst erzeugte elektrische Feld moduliert wird. Die MS-Analyse isolierter Zentrosomen führte zur Identifizierung von 260 Proteinen, welche anschließend mittels RNAi in kultivierten Drosophila-Zellen untersucht wurden. Die daraus resultierenden Phänotypen wurden mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie und FACS ausgewertet. Diese Analyse zeigte, dass eine Gruppe von 11 Proteinen eine kritische Rolle in der Aufrechterhaltung der zentrosomalen Struktur spielt, da ihr Abbau zum Zerfall des Proteinkomplexes führte. Hierbei wurde eine Abhängigkeit von Komponenten der Translationsmaschinerie, sowie Actin und nukleären Proteinen aufgedeckt. Insgesamt wurde 27 Proteinen eine neue Zentrosomen-bezogene Funktion zugeordnet, von denen 14 durch siRNA- vermittelten Abbau der homologen Proteine in humanen Zellen bestätigt wurden. Die Analyse humaner Orthologe zeigte zudem einen hohen Grad an funktioneller Konservierung der Proteine, die in die Verdopplung und Separation von Zentrosomen impliziert sind. Zusätzlich zu der Gesamt-Proteomanalyse des Drosophila-Zentrosoms sollten in einer zweiten Proteomstudie die Substrate zentrosomaler Kinasen identifiziert sowie deren Funktion aufgeklärt werden. Durch die Anreicherung von Phosphopeptiden aus zentrosomalen Präparaten und deren anschließender MS-Analyse wurden 45 Phosphorylierungsstellen in 27 Proteinen identifiziert. 17 der 45 Phosphorylierungsstellen sind bisher nicht beschrieben worden. Alle MS-identifizierten Proteine wurden im Anschluss funktionell charakterisiert und in regulatorische Signalnetzwerke mit den 3 wichtigsten mitotischen Kinasen, cdc2, polo, aur sowie der `house- keeping´-Kinase CkIIβ integriert. Eine kombinatorische RNAi-Strategie deckte neue Funktionen in der Zentrosomen-Verdopplung, -Reifung und -Separation für Proteine der nukleären Hülle, Bestandteile von `P granules´ sowie nukleäre Proteine auf. Ausgewählte Phosphoproteine wurden als getaggte Fusionsproteine in Drosophila-Zellen exprimiert, wodurch bisher unbekannte Lokalisationen am Zentrosom beziehungsweise an der Spindel nachgewiesen wurden. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass diese Arbeit eine umfassende molekulare und funktionelle Beschreibung des Drosophila-Zentrosoms und darüber hinaus die erste Bestandsliste Zentrosomen-spezifischer in vivo Phosphorylierungs-Stellen beinhaltet. Insofern stellt die vorliegende Arbeit eine wichtige Grundlage für zukünftige Studien dar, die ein besseres molekulares Verständnis der Mechanismen der Zentrosomenbiogenese und der verschiedenen zentrosomalen Funktionen im Zellzyklus sowie in zellulären Signalwegen ermöglichen wird.
