Protease-activated receptor 2 (PAR2) is broadly expressed on endothelial cells contributing to inflammatory processes and angiogenesis. Autoantibodies against PAR2 can regulate these functions in health and disease. Recently, a collaboration group discovered in a prospective observational cohort study that stroke patients with a higher concentration (highest quartile Q4) of PAR2-IgG presented a poor clinical outcome compared to others (lower quartiles Q1-3). However, the biological functions and molecular mechanism remain unclear. Therefore this study aims to explore the possible function of PAR2-IgG on endothelial-based angiogenesis which might have an essential impact on clinical outcome after stroke. Methods: IgGs were isolated from the sera of stroke patients (Q1-3 and Q4), then Matrigel angiogenesis assay was used to study vascular tube formation by IgGs and the natural PAR2 agonist trypsin in vascular endothelial cells (HMEC-1 and hCMEC/D3, a blood-brain barrier human endothelial cell line). Additionally, qRT-PCR, western blot, and ELISA were used to investigate the angiogenic signaling pathways. The activation of G-protein subunits was examined by the Luciferase reporter assay, based on mutations of wild-type PAR2 and extracellular loops (ECLs). The receptor internalization was studied by Nano-Glo ®HiBiT detection assay. The main inductor of angiogenesis VEGF was examined in detail by promoter assay with regard to the activation of the promoter and potential binding fragments of transcription factors. Results: The PAR2 agonist trypsin was involved in the regulation of mRNA synthesis and protein release of VEGF, IL-6, IL-8, CXCL1 and ANG2 through the ERK1/2 signaling pathway, which promoted vascular tube formation of HMEC-1. Q1-3 PAR2-IgG enhanced angiogenesis via PAR2-ERK1/2-induced angiogenic cytokines and receptor internalization when compared to Q4 PAR2-IgG. Q1-3 PAR2-IgG 10 triggered Gq/11 activation -, but not G12/13 -, and the mutation of ECL1-3 did not alter the activation. As for Q4, the ECL3 mutation increased the Gq/11 activation and ERK1/2 activation. Different truncations of the VEGF promoter assay confirmed the binding sites of transcription factors located in the VEGF promoter sequence -1339 to -839 bp, and the inhibition of AP-1 completely blocked the promoter activation. To summarize, in contrast to the Q4 group, Q1-3 PAR2-IgG induced greater receptor internalization, Gq/11 activation, ERK1/2 activation, and angiogenic gene production, which resulted in increased formation of vascular tubes. Conclusion: The present work elucidated new PAR2 signaling pathways that are induced by PAR2-IgG in human endothelial cells and identified contrary functional consequences on the angiogenesis of PAR2-IgGs from two different stroke patient cohorts classified by different PAR2-IgG titer ranges. Novel therapeutics modulating PAR2-IgGs in stroke patients might thereby already limit stroke progression at an early stage and lead to improved clinical outcome.
Hintergrund: Protease-aktivierter Rezeptor 2 (PAR2) ist auf Endothelzellen hoch exprimiert und reguliert inflammatorische Prozesse und Angiogenese. Autoantikörper gegen PAR2 können diese Funktionen physiologisch und pathophysiologisch beeinflussen. Vor kurzem entdeckten Kollaborationspartner in einer prospektiven Kohortenstudie, dass Schlaganfallpatienten mit hohen PAR2-Spiegeln (höchstes Quartil Q4) einen schlechteren klinischen Outcome hatten als Patienten mit niedrigeren Spiegeln (Quartile Q1-3). Die molekularen Mechanismen dafür waren allerdings ungeklärt. Es war daher das Ziel dieser Studie, eine mögliche Bedeutung dieser PAR2-IgGs auf endotheliale Angiogenese zu untersuchen, die sich positiv auf den klinischen Outcome auswirken könnten. Methoden: IgGs wurden von Schlaganfallpatienten (Q1-3 und Q4) isoliert und dann der Matrigel Angiogenese Assay benutzt, um Gefäßbildungen von Endothelzellen (HMEC-1 und hCMEC/D3, einer humanen Bluthirnschranken-Endothelzelllinie) durch die IgGs und den natürlichen Agonisten von PAR2, Trypsin, zu untersuchen. Weiterhin dienten qRT-PCR, Westernblots und ELISA zur Erforschung angiogenetischer Signalwege. Luziferase-Reporter-Assays wurden durchgeführt, um die Aktivierung von G-Protein-Untereinheiten mithilfe von Mutationen von Wildtyp-PAR2 und der extrazellulären Schleifen (ECLs) zu untersuchen. Die Internalisierung des Rezeptors wurde visualisiert mit dem Nano-Glo ®HiBiT Detektionsassay. Der Hauptaktivator der Angiogenese, VEGF, wurde detailliert untersucht mithilfe von Promotoraktivierungsstudien und Bindungsfragmente. Ergebnisse: Der PAR2 Agonist Trypsin beeinflusste die mRNA Synthese und Proteinfreisetzung von VEGF, IL-6, IL-8, CXCL1 und ANG2 über den ERK1/2 Signalweg und förderte die Ausbildung vaskulärer Gefäßschläuche in HMEC-1. Im Vergleich zu Q4 PAR2-IgG erhöhte Q1-3 PAR2-IgG Angiogenese durch Freisetzung von 13 angiogentischer Zytokine über PAR2-ERK1/2-Aktivierung und Rezeptorinternalisierung. Q1-3 PAR2-IgG triggerte die Aktivierung von Gq/11, aber nicht von G12/13, und Mutationen von ECL1-3 hatten keinen Einfluss auf die Aktivierung. VEGF Promotorassays bestätigten die Bindungsstelle des Transkriptionsfaktors AP-1 an der VEGF-Promotorsequenz -1339 bis -839 bp. Zusammenfassend induzierte Q1-3 PAR2-IgG im Gegensatz zu Q4 PAR2-IgG eine verstärkte Rezeptorinternalisierung, Gq/11 – und ERK1/2-Aktivierung und Induktion angiogenetischer Gene, was in einer verstärkten Netzwerkbildung resultierte. Schlussfolgerung: Die hier dargestellte Arbeit beschreibt neue Signalwege von PAR2 in humanen Endothelzellen, die durch PAR2-IgG aktiviert werden und identifizierte gegensätzliche Auswirkungen auf Angiogenese durch PAR2-IgG von zwei unterschiedlichen Schlaganfallkohorten mit besonders hohen (Q4) oder niedrig-mäßigen (Q1-3) PAR2-IgG-Spiegeln. Die Modulation von PAR2-IgGs könnte eine neue Therapieform bei Schlaganfall darstellen, um die Progression im Verlauf zu verhindern und zu verbessertem klinischem Outcome zu führen.
