EINLEITUNG Der außerklinische Herz-Kreislauf-Stillstand (HKS) hat global eine hohe Inzidenz und Mortalität. In der Behandlung nach HKS kommt therapeutische Hypothermie (TH) zur Anwendung, um das neurologische Outcome zu verbessern. TH hat darüber hinaus möglicherweise eine kardioprotektive Wirkung. Im ersten Teil der Arbeit wurde der Einfluss von intraischämischer Anwendung von moderater TH (33,5 °C) auf Überleben, Metabolismus und Apoptose von Kardiomyozyten und die Rolle zugrundeliegender Signalproteine untersucht. Im zweiten Teil wurden die Zellen mit einem Opioid ([D Ala2, D Leu5] Enkephalin = DADLE) und einem Cannabinoid (WIN-55,212-2 = WIN) behandelt und deren Wirkung auf die Kardiomyozyten untersucht. Die Ergebnisse wurden mit denen des ersten Teils verglichen. Dabei wurde auch ein möglicher synergistischer Effekt der Kombination von pharmakologischer Therapie und TH geprüft. METHODEN Unsere Studie basiert auf einem Zellkulturmodell mit murinen atrialen HL-1 Kardiomyozyten. Ischämie wurde in einer Hypoxiekammer (0,2 % O2) in glukose- und serumfreiem Medium für 6 Stunden simuliert. Nach 3 Stunden erfolgte die Einleitung von moderater TH, die über weitere 3 Stunden bei simulierter Ischämie fortgeführt wurde. Das Ausmaß der Zellschädigung wurde unter Anwendung der Zellzählung und der Erfassung von Laktatdehydrogenase (LDH) untersucht. Eine Aussage zur metabolischen Aktivität wurde über die Messung der intrazellulären ATP-Level getroffen. Mit Hilfe der M30 CytoDEATH Immunfärbung wurde frühe Apoptose und mit Western Blotting die Signalproteine ERK, Akt und HO-1 detektiert. Um die Wirkung von DADLE und WIN mit TH vergleichen zu können, wurde die LDH-Ausschüttung untersucht. ERGEBNISSE Intraischämische moderate TH (33,5 °C) führte zu einer signifikanten Reduktion der LDH-Ausschüttung, höheren Zellzahlen und einem höheren intrazellulären ATP-Gehalt verglichen mit der normothermen Ischämiegruppe (37 °C). Die Untersuchungen zeigten eine geringere M30 CytoDEATH Anfärbung für frühe Apoptose in der TH-Gruppe. ERK wird möglicherweise durch intraischämische TH induziert. DADLE zeigte sich in der Zytoprotektion bei Ischämie der TH überlegen und WIN ist potentiell kardioprotektiv. Es wurde kein synergistischer Effekt durch die zeitgleiche Anwendung von DADLE und TH analysiert. Die Kombination von WIN und TH hob die zytoprotektive Wirkung auf. SCHLUSSFOLGERUNG Zeitige Anwendung von TH vor Reperfusion ist eine vielversprechende Therapie zur Kardioprotektion nach außerklinischem HKS. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Kardioprotektion von TH durch Verhinderung apoptotischer Prozesse während Ischämie vermittelt wird. Außerdem kann geschlussfolgert werden, dass zellschützende Effekte durch Behandlung mit DADLE und WIN erzielt werden können. Es erfordert weiterführende Forschung, um die Wirkmechanismen umfassender zu verstehen und um die laborexperimentellen Ergebnisse auf die klinische Arbeit am Patienten zu übertragen.
INTRODUCTION Out of hospital cardiac arrest (OHCA) has globally a high incidence and mortality. Therapeutic Hypothermia (TH) is mainly applied to improve neurological outcome and is most likely cardioprotective. In the first part of the study, the effects of intra-ischemic application of moderate TH (33.5 °C) on cardiomyocyte cell survival, metabolism and apoptosis were investigated. Furthermore, potential underlying signal proteins were examined. In the second part, we compared treatments of cardiomyocytes with an opioid ([D Ala2, D Leu5] enkephalin = DADLE) and a cannabinoid (WIN-55,212-2 = WIN) to the protective impact of TH. Each substance was also combined with TH to investigate potential synergistic effects. METHODS Our study is based on a cell culture model of murine atrial HL-1 cardiomyocytes. Ischemia was simulated in a hypoxic chamber (0.2 % O2) in glucose and serum free medium for 6 hours. After 3 hours, moderate hypothermia (33.5 °C) was applied for the remaining 3 hours of simulated ischemia. Cell damage and viability was determined by lactate dehydrogenase (LDH) release and Trypan Blue cell staining. Cell metabolism was measured via intracellular ATP levels. Apoptosis was detected by M30 CytoDEATH immunostaining. Protein expression of ERK, Akt and HO 1 were assessed through Western Blotting. To compare the effect of DADLE and WIN to TH, we analyzed LDH release. RESULTS Intra-ischemic moderate TH (33.5 °C) led to increased cell viability as demonstrated in significantly lower LDH release, higher cell number and higher intracellular ATP level in comparison to normothermic ischemia (37 °C). We obtained less M30 CytoDEATH staining for early apoptosis. ERK was likely to be induced by intra-ischemic TH. DADLE was more effective as TH and WIN potentially cardioprotective. There was no synergistic effect by combining DADLE and TH. The combination of WIN and TH abolished the cytoprotective effect. CONCLUSION Early application of TH before reperfusion is a promising treatment for cardioprotection in OHCA. In this study, we demonstrated that cell survival is mediated by attenuating apoptotic pathways during ischemia. Also, we could show that the cell preserving effect of TH can be mimicked by treatment with DADLE or WIN. Pharmacological interventions are likely to be superior to TH regarding effectiveness and side effects. Further studies are required to elucidate the mechanism of action and to transfer the results from bench to bedside.
