Ziel dieser Arbeit war die strukturelle Charakterisierung der homologen Proteine GRASP65 (Homo sapiens) und Grh1 (Saccharomyces cerevisiae) mittels Röntgen¬kristallographie, sowie die Untersuchung des Bindemechanismus von GRASP65•GM130 und Grh1•Bug1 bzw. Grh1•Uso1. GRASP65 ist in der Stapelung von Golgi-Zisternen involviert und befindet sich an der cis-Seite des Golgi- Apparates. Durch Interaktion mit dem Golgin GM130 vermittelt GRASP65 das Andocken von Transportvesikeln an die Golgi-Membran. Grh1 ist das GRASP65-Homolog in der Knosphefe Saccharomyces cerevisiae. Wie sein humanes Pendant ist auch Grh1 am Golgi-Apparat lokalisiert. Beide Proteine können in zwei Regionen unterteilt werden: eine N-terminale GRASP- und eine C-terminale SPR-Domäne, wobei die GRASP-Domäne wiederum in zwei PDZ-Domäne unterteilt wird. Die Strukturanalyse der beiden einzelnen PDZ-Domänen von GRASP65, GRASP65PDZ1 und GRASP65PDZ2 zeigt für beide Strukturen eindeutig eine β-sandwich Faltung, wie sie auch für andere PDZ-Domänen beschreiben wurde. Es wurden Bindungsstudien von GRASP65 mit dem bekannten Interaktionspartner GM130 durchgeführt. Im Gegensatz zu bereits publizierten Daten konnte keine Bindung von GM130-Peptiden an die zweite PDZ-Domäne von GRASP65 nachgewiesen werden. Für eine Interaktion mit GM130 ist die vollständige GRASP-Domäne notwendig. Die Bindungskonstante dieser Interaktion liegt mit KD=10,0 ± 2,9 µM innerhalb des Bereiches, der auch für andere PDZ-Peptid-Interaktionen ermittelt wurde. Da eine Co-Kristallisation der GRASP-Domäne von GRASP65 und GM130 nicht möglich war, wurden in einem Modell die beiden kristallographisch bestimmten PDZ-Domänen von GRASP65 zu einer GRASP-Domäne kombiniert und das GM130-Peptid eingepasst. Es zeigte sich das typische Bindungsmuster eines Klasse I-Peptids in die Peptid-Bindungs¬tasche einer PDZ-Domäne, das mit Funktionsstudien anderer PDZ-Domänen gut in Einklang zu bringen ist. Der strukturelle Vergleich von GRASP65PDZ1 und der ersten PDZ-Domäne von Grh1, Grh1PDZ1ΔβB, zeigt große Übereinstimmungen. Bisher konnte jedoch nicht abschließend geklärt werden, welche Funktion Grh1 in Hefe hat, denn die Knosphefe verfügt, im Gegensatz zu Säugerzellen, über keine zu Golgi-Stapeln organisierten Zisternen. Daher wirft das Vorkommen eines Proteins, das in die Stapelung von Golgi-Zisternen involviert ist, Fragen zu seiner Funktion auf. Bindungsstudien, analog zu GRASP65, mit potentiellen Interaktionspartnern von Grh1 wie Bug1 und Uso1, sollten Hinweise auf eine mögliche Funktion geben. Obwohl eine Vielzahl unterschiedlicher Grh11-Konstrukte hergestellt und getestet wurde, konnte keine der Interaktionen bestätigt werden. Die Frage der genauen Funktion von Grh1 bleibt offen.
The aim of this study was to structurally characterize the homologous proteins GRASP65 (Homo sapiens) and Grh1 (Saccharomyces cerevisiae) by X-ray crystallography as well as to analyze the binding mechanism of GRASP65•GM130 and Grh1•Bug1 or Grh1•Uso1. GRASP65 localizes to the cis side of the Golgi apparatus and part of the Golgi cisternae stacking machinery. Due to its interaction with GM130, GRASP65 is involved in the docking of transport vesicles to the Golgi membrane. Like its human homologue, Grh1 also localizes to the Golgi apparatus. Both proteins, GRASP65 and Grh1, can be divided into two different regions: an N-terminal GRASP domain and a C-terminal SPR domain. The GRASP domain can be further separated into two PDZ domains. Crystal structures of both single PDZ domains of GRASP65 were determined. GRASP65PDZ1 as well as GRASP65PDZ2 reveal a β-sandwich fold typical for PDZ domains. We analyzed the interaction between GRASP65 and GM130 by ITC measurements to obtain binding constants. Earlier experiments demonstrated that GM130 interacts with the second PDZ domain of GRASP65. In our study the complete GRASP domain of GRASP65 was necessary for interaction with GM130. The binding constant of KD=10.0 ± 2.9 µM is of the same magnitude as seen for other PDZ- peptide interactions. Co-crystallization of the GRASP domain of GRASP65 and GM130 was not possible. Therefore, we combined in silico the single PDZ domains of GRASP65 to obtain a complete GRASP domain model where upon the GM130 peptide was docked. Our model demonstrates typical binding between a class I peptide and a ligand-binding pocket. During this work the structure of Grh1PDZ1ΔβB was also determined. Superposition shows high structural similarity between GRASP65PDZ1 and Grh1PDZ1ΔβB. So far, the function of Grh1 is not known in detail. Golgi stacks are not observed in budding yeast – in contrast to mammalian cells – but the Golgi stacking protein Grh1 is present in budding yeast. In analogy to GRASP65, binding studies with peptides from potential interaction partners Bug1 and Uso1 would have provided insight into the function of Grh1. However, we could not confirm binding with our designed constructs. Thus, the question about the biological function of Grh1 remains open.
