Despite intense research efforts, epithelial ovarian cancer (EOC) invariably remains the most lethal gynecological malignancy in women. In the absence of biomarkers capable of detecting EOC at an early, still curable stage, altered glycosylation of proteins attracted attention as a potential source of complementary screening markers. While changes of total serum N-glycome in EOC patients have been broadly examined, there is so far only limited data available on glycosylation alterations occurring in individual serum-derived glycoproteins and ovarian cancer tissue. Therefore, to fill this gap of knowledge, EOC-related glycosylation changes were investigated in this thesis at the level of immunoglobulin G (IgG), the most abundant serum glycoprotein, and at the level of EOC tissue, implementing cutting-edge technology, MALDI mass spectrometry imaging (MALDI-MSI). In humans, IgG occurs as four subclasses, IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4, which differ sharply in respect to their biological characteristics and effector functions despite high homology at the amino acid level. Although IgG glycosylation in EOC patients has already been investigated previously, EOC-related glycosylation alterations were determined at the level of enzymatically released N-glycans. In consequence, currently available data give only global information and is neither subclass- nor site (Fc/Fab)-specific. Therefore, in order to provide a deeper insight into glycomic changes accompanying the development and progression of EOC, in this work, glycosylation alterations were investigated in a subclass-specific manner, performing the analysis at the glycopeptide level. To this end, IgG was isolated from blood sera of 87 EOC patients (FIGO stage I-IV) and 74 age- and sex-matched healthy controls. In order to separate IgG2 and IgG3, whose peptide backbones encompassing the Asn297-glycosylation are frequently identical, a two-step affinity purification employing Protein A and Protein G Sepharose was performed. Isolated IgG fractions containing IgG1, IgG2, IgG4, and IgG3, respectively, were digested with trypsin, and the resulting glycopeptides were enriched using cotton-HILIC columns. Finally, measurements were performed by MALDITOF-MS in negative ionization mode. By summing up relative intensities of respective glycopeptide structures, six (or five in the case of IgG2) glycosylation traits, namely a-, mono-, digalactosylation, sialylation, bisection, and fucosylation, were calculated separately for IgG1-3 subclasses (analysis of IgG4 was omitted due to its very low serum concentration and overlapping glycopeptide signals). In all investigated IgG subclasses, mono- and digalactosylation were found to decrease in patients suffering from early- and late-stage EOC. Notably, as glycosylation profiles of all investigated subclasses were observed to alter with increasing age, the EOC-related alterations were more pronounced in younger patients. Additionally, the detected subclass-specific glycosylation features indicate that each IgG subclass responds slightly differently to the outbreak of the disease. Above all, IgG1 showed the most pronounced EOC-related glycosylation alterations, and its agalactosylation showed the strongest association with CA 125 routine diagnostic marker. Additionally, as compared to IgG2 and IgG3, the combination of IgG1 glycosylation with the CA 125 marker showed the best performance in distinguishing healthy controls from EOC patients, irrespective of patients’ age and EOC stage. Furthermore, the results of this work imply that a common analytical practice of simultaneous analysis of IgG2 and IgG3 subclasses should be avoided due to their noticeably different glycosylation phenotypes. The aim of the second part of this work was to determine glycosylation alterations occurring directly on glycoproteins expressed in ovarian cancer cells and their surroundings. Analyses were performed using MALDI-MSI technique that enables the visualization of the spatial distribution of numerous analytes in a single imaging experiment. The investigated material consisted of formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens of the most common and aggressive EOC type, high-grade serous ovarian cancer, less aggressive low-grade serous, clear cell, and endometrioid ovarian cancer as well as non-malignant borderline ovarian tumor. All tissue specimens were deparaffinized, rehydrated, and subjected to heat-induced antigen retrieval. Negatively charged sialic acids were chemically derivatized in a linkage-specific manner, after which all tissue-contained N-glycans were released in situ with PNGase F. Ultimately, released N-glycans were measured using a rapifleX MALDI Tissuetyper. The applied protocol allowed the detection of over 60 m/z species corresponding to high-mannose-, hybrid-, and complex-type neutral and sialylated N-glycans. Importantly, observed N-glycans were diversely distributed within distinct tissue regions, defined by a pathologist prior to the analysis. High-mannose N-glycans were predominantly detected in tumor regions, while neutral complex-type N-glycans were more abundant in non-tumor tissue areas. Due to the mass shift introduced via a chemical derivatization reaction, the sialylated structures carrying α2,3- and α2,6-linked sialic acids could be distinguished. Notably, this is the first study, in which in situ sialylation of EOC tissue was investigated in its stabilized form and a linkage-specific manner. Importantly, the distribution of differently sialylated N-glycan structures within the tissue was observed to vary. While α2,6-sialylated N-glycans were enriched in tumor and tumor-related necrotic regions, α2,3-sialylated N-glycans were predominantly present in non-tumor tissue. Ultimately, statistical analyses revealed tissue type-specific N-glycan structures, which support EOC diagnosis and pave the way to serve as biomarkers to discriminate between cancerous and noncancerousovarian tissue.
Trotz intensiver Forschung auf dem Gebiet der Diagnostik und Therapie ist das epitheliale Ovarialkarzinom (EOC) nach wie vor die tödlichste gynäkologische Krebsentität bei Frauen. Das Fehlen von sensitiven und spezifischen Biomarkern für die Diagnose von EOC in einem frühen, noch heilbaren Stadium, hat die Aufmerksamkeit auf die Untersuchung der veränderten Proteinglykosylierung gelenkt, welche als ergänzende Screening Marker eingesetzt werden könnten. Während das Serum-N-Glykom bei EOC-Patientinnen umfassend untersucht wurde, gibt es nur wenige Daten zu Glykosylierungsveränderungen, der einzelnen in Serum oder im Gewebe vorkommenden Glykoproteine. Um diese Wissenslücke zu schließen, wurden in dieser Arbeit EOC-spezifische Glykosylierungsveränderungen des häufigsten Serumglykoproteins Immunglobulin G (IgG) ausführlich analysiert. Ergänzend dazu, wurde das gesamte Gewebe-N-Glykom diverser morphologischer Subtypen des EOCs mittels hochmoderner Technologie, der MALDIMassenspektrometrie-Bildgebung (MALDI-MSI) untersucht. Das humane IgG wird in vier Subklassen unterteilt: IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4. Diese Subklassen unterscheiden sich hinsichtlich deren biologischen Eigenschaften und Effektorfunktionen, wobei deren Aminosäuresequenzen hohe Homologien aufweisen. Glykosylierungsveränderungen von IgG wurden bereits bei EOC Patientinnen auf der Ebene enzymatisch freigesetzter N-Glykane intensiv untersucht. Die derzeit verfügbaren Daten dieser Untersuchungen können jedoch nur grundlegende Informationen geben und sind weder subklassen- noch ortsspezifisch (Fc/Fab). Um einen tieferen Einblick in die Veränderungen des Glykoms im Krankheitsverlauf des EOCs zu bekommen, wurde daher der Fokus dieser Arbeit auf die Untersuchung subklassenspezifischer Veränderungen der Glykosylierung gelegt. Hierfür wurde eine umfassende Analyse auf Glykopeptidebene durchgeführt. Das IgG wurde aus dem Blutserum von 87 EOC Patientinnen (FIGO-Stadium I-IV) und 74 alterskorrelierenden gesunden Kontrollen isoliert. Zur Separation von IgG2 und IgG3, die über eine in den meisten Fällen identische Peptidsequenz mit der Asn297-Glykosylierungsstelle verfügen, wurde eine zweistufige Aufreinigung mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung von Protein A (IgG1, IgG2, IgG4) und Protein G Sepharose (IgG3) durchgeführt. Isolierte IgG-Fraktionen wurden mit Trypsin verdaut und die resultierenden Glykopeptide mit HILIC-Säulen angereichert. Die Vermessung der Glykopeptide wurde mittels MALDI-TOF-MS im negativen Ionisierungsmodus durchgeführt. Durch Summation der relativen Intensitäten der jeweiligen Glykopeptidstrukturen wurden folgende sechs (bzw. fünf im Falle von IgG2) Glykosylierungsmuster ermittelt: A-, Mono-, Digalaktosylierung, Sialylierung, bisecting GlcNAc Strukturen und Fukosylierung für die Unterklassen IgG1-3 berechnet. Die Analyse von IgG4 wurde aufgrund einer geringen Serumkonzentration und überlappender Glykopeptidsignale nicht durchgeführt. In allen untersuchten IgG Subklassen wurde eine Abnahme der Mono- und Digalaktosylierung unabhängig vom Stadium der Krankheit festgestellt. Bemerkenswert ist zudem, dass sich die Glykosylierungsprofile aller untersuchten Subklassen mit zunehmendem Alter verändern, wobei die EOC bedingten Veränderungen bei jüngeren Patientinnen stärker ausgeprägt sind. Zusätzlich deuten die subklassenspezifischen Glykosylierungsmuster darauf hin, dass jede IgG-Subklasse leicht unterschiedlich auf die Entwicklung der Krankheit anspricht. Vor allem IgG1 zeigte die auffälligsten EOC spezifischen Glykosylierungsveränderungen, wobei die Agalaktosylierung die stärkste Assoziation zu dem diagnostischen Marker CA 125 aufwies. Des Weiteren ergab die Kombination der IgG1-Glykosylierung und dem CA 125 Marker im Vergleich zu IgG2 und IgG3 die beste diagnostische Prognose bei der Differenzierung gesunder Kontrollen von den EOC-Patientinnen unabhängig vom Alter und Stadium der Krankheit. Darüber hinaus konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine simultane Analyse von IgG2 und IgG3 aufgrund ihrer deutlich unterschiedlichen Glykosylierungsphänotypen vermieden werden sollte. Ziel des zweiten Teils dieser Arbeit war es, Glykosylierungsveränderungen von Glykoproteinen zu bestimmen, die in Eierstockkrebszellen und deren direkten Umgebung exprimiert werden. Die Analyse wurde mittels MALDI-MSI durchgeführt, die eine Visualisierung der räumlichen Verteilung zahlreicher Analyten in einem einzigen Bildgebungsexperiment ermöglicht. Das untersuchte Material bestand aus Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeproben. Neben den Gewebeproben von dem häufigsten und aggressivsten EOC Subtypen, dem high-grade serösen Ovarialkarzinom, wurden auch weniger aggressive low-grade seröse, klarzellige sowie endometrioide Ovarialkarzinoma und überwiegend gutartigen borderline-Ovarialtumore untersucht. Alle Gewebeproben wurden de-paraffiniert, rehydriert und einer thermischen Epitopdemaskierung unterzogen. Negativ geladene Sialinsäuren wurden chemisch und damit einhergehend bindungsspezifisch derivatisiert, woraufhin alle im Gewebe enthaltenen N-Glykane mit dem Enzym PNGase F in situ freigesetzt wurden. Die freigesetzten N-Glykane wurden anschließend mit einem rapifleX MALDI Tissuetyper gemessen. Das verwendete Protokoll erlaubte die Detektion von über 60 m/z Spezies, wobei sowohl die neutralen als auch die negativ geladenen sialylierten N-Glykane dem Oligomannose-, Hybrid- und Komplex-Typ entsprachen. Auffällig war, dass die detektierten N-Glykantypen in den von Pathologen definierten Geweberegionen, distinkt verteilt waren. N-Glykane mit hohem Oligoannose Gehalt wurden vor allem in Tumorregionen nachgewiesen, während die neutralen komplexen N-Glykane häufiger in Gewebebereichen ohne Tumorzellen nachgewiesen werden konnten. Aufgrund der chemischen Derivatisierungsreaktion und damit einhergehender Massenverschiebung konnten die α2,3- und die α2,6-sialylierten N-Glykanstrukturen bindungsspezifisch detektiert werden. Somit handelt es sich um die erste Studie, in der eine in situ Sialylierung der N-Glykane in seiner stabilen und bindungsspezifischen Form im EOC Gewebeproben dargestellt werden konnte. Beachtenswert ist dabei, dass die unterschiedlich sialylierten N-Glykanstrukturen sich im Gewebe spezifisch verteilten. Während die α2,6-sialylierten N-Glykane im Tumor und in tumornahen nekrotischen Regionen vorkamen, wurden die α2,3-sialylierten N-Glykane vorwiegend in den von tumorfreien Regionen detektiert. Mit Hilfe von statistischer Analyse konnte eine Reihe von gewebetypspezifischen N-Glykanen ermittelt werden, die eine Diskriminierung von kanzerogenem und nicht-kanzerogenem Ovarialgewebe erleichtert und ferner potenziell als Biomarker zur Diagnose des epithelialen Ovarialkarzinoms eingesetzt werden könnte.