The eukaryotic transcription machinery consisting of RNA polymerase II (Pol II) and a small number of minimally required initiation, elongation and termination factors is well-characterized structurally and biochemically, while functional characterization traditionally has been hampered by the limitations of the available perturbation strategies and readouts. In addition, knowledge of accessory transcription regulators is likely incomplete. Proteins of the conserved bromodomain and extra-terminal domain (BET) family have been demonstrated to function in maintaining normal transcription genome-wide by promoting elongation. However, the underlying molecular mechanism and also the specific contribution of each of the protein family members remained elusive. Moreover, it was unclear if BET proteins serve additional direct or indirect functions in transcription or transcription-coupled processes.
To address these aspects, this study combines targeted protein degradation, a new strategy to near-completely deplete a protein of interest within minutes to hours, with complementary transcriptome-, genome- and proteome-wide readouts of high temporal or spatial resolution. It provides evidence that specifically BRD4 is involved in transcription control, although BRD2 and BRD3 might have partially overlapping functions. Within 120 minutes, BRD4-selective degradation results in a global reduction of elongating Pol II from the gene body of most protein-coding and long non-coding RNA genes, as can be detected by native elongating transcript sequencing with spike-in normalization (SI-NET-seq). Concomitantly, Pol II accumulates in the promoter-proximal region, suggesting a defect in promoter-proximal pause release. Profiling elongation factors upon BRD4 depletion reveals a decrease in occupancy, suggesting an assembly defect of the active elongation complex. In particular, PAF1 binding is decreased throughout the transcribed region.
Unexpectedly, BRD4-selective degradation also induces a severe transcription termination defect at a subset of genes. Particularly, Pol II continues transcribing on average three kilobases beyond its usual termination zone, which is accompanied by inefficient cleavage of the nascent transcript at the pA site. Chromatin immunoprecipitation with sequencing (ChIP-seq) reveals a significant reduction of RNA 3’ end processing factors of the CPSF and CstF modules near the 3’ gene end as well as in the promoter-proximal and the gene body region. The failure to recruit RNA 3’ end processing as well as PAF subunits, SPT5 and SPT6, but not CDK9, could be independently confirmed by quantitative mass spectrometry. Co-immunoprecipitation experiments indicate that the recruitment of 3’ processing factors either directly depends on BRD4 or could be mediated by elongation factors.
Also, BRD4-selective degradation locally increases the binding of Pol II and SPT5 at transcribed enhancers, whereas enhancer accessibility appears to be not BRD4-dependent.
Altogether, the data establish a role of BRD4 in coordinating the recruitment of elongation and RNA 3’ end processing factors during an early step of transcription.
Die eukaryotische Transkriptionsmaschinerie — insbesondere RNA-Polymerase II (Pol II) und eine überschaubare Gruppe essentieller Initiation-, Elongations- und Terminationsfaktoren — ist strukturell als auch biochemisch gut charakterisiert, wohingegen die funktionelle Charakterisierung durch das Fehlen geeigneter Pertubationsmethoden und sensitiver experimenteller Analyseverfahren lange erschwert wurde. Auch sind viele nicht-essentielle Transkriptionsregulatoren wahrscheinlich noch unbekannt. Es konnte gezeigt werden, dass die durch zwei Bromodomänen und eine sog. extra-terminale Domäne gekennzeichneten Proteine der konservierten BET-Proteinfamilie nötig sind, die normale Transkriptionsaktivität der Zelle — vermutlich durch Regulation der Elongation — aufrecht zu erhalten. Unklar sind jedoch der molekulare Mechanismus als auch die Rolle der einzelnen Proteine der Proteinfamilie. Darüber hinaus ist denkbar, dass BET-Proteine direkt oder indirekt auch an weiteren transkriptionellen oder co-transkriptionellen Prozessen beteiligt sind.
Die genannten Aspekte adressiert die vorliegende Studie einerseits durch die Verwendung eines relativ neuen Verfahrens zur gezielten und schnellen Degradierung eines Proteins — in diesem Fall BRD4 — und andererseits mit komplementären transkriptom-, genom- und proteomweiten Methoden, die eine hohe zeitliche oder räumliche Auflösung bieten. Auf diese Weise kann gezeigt werden, dass die Transkription in hohem Maße von BRD4 abhängt, obgleich nicht auszuschließen ist, dass BRD2 oder BRD3 eine ähnliche Funktion haben. So belegt SI-NET-seq, eine spike-in-gestützten Methode zur quantitativen Analyse naszenter RNA unter nativen Bedingungen, dass die gezielte Degradierung von BRD4 innerhalb von 120 Minuten zur globalen Verringerung transkribierender Pol II am Genkörper der meisten proteinkodierenden und langen nicht-kodierenden RNA-Gene führt. Gleichzeitig akkumuliert transkribierende Pol II in der promotor-proximalen Region, was auf einen Defekt am Übergang von der promotor-proximalen Pause zur produktiven Elongation hindeutet. Einen Hinweis auf eine Funktion von BRD4 bei der Assemblierung des Elongationskomplexes liefert die Beobachtung, dass die Chromatinbindung von Elongationsfaktoren nach BRD4-Degradierung verringert ist. Insbesondere PAF1 zeigt eine Abnahme in allen Genbereichen.
Unerwarteterweise führt die gezielte Degradierung von BRD4 bei einer großen Gruppe von Genen auch zu einem Terminationsdefekt — im Durchschnitt erfolgt die Termination drei Kilobasen später als unter Kontrollbedingungen — und vermindert die Effizient, mit der die naszente RNA an der Polyadenylierungsstelle enzymatisch geschnitten wird. Tatsächlich binden CPSF- und CstF-Faktoren der 3'-RNA-Prozessierungsmaschinerie nach BRD4-Degradierung signifikant weniger am 3'-Ende der Gene, aber auch im promotor-proximalen Bereich und am Genkörper, wie mittels Chromatinimmunpräzipitation (ChIP) gezeigt werden kann. Eine signifikante Abnahme von 3'-Prozessierungsfaktoren sowie von PAF-Untereinheiten, SPT5 und SPT6, nicht aber von CDK9, ist auch durch quantitative Massenspektrometrie nachweisbar. Zudem legen Co-Immunpräzipitationsexperimente nahe, dass 3‘-RNA-Prozessierungsfaktoren entweder direkt durch BRD4 oder indirekt über Elongationsfaktoren rekrutiert werden können.
Außerdem korreliert die BRD4-spezifische Degradierung mit der lokalen Zunahme von Pol II und SPT5 an transkribierten Enhancer-Regionen; die Zugänglichkeit des Chromatins gegenüber Tn5-Transposase erscheint hingegen nicht BRD4-abhänging zu sein.
Zusammenfassend legen unsere Daten nahe, dass BRD4 zu einem relativ frühen Zeitpunkt des Transkriptionszyklus' die Rekrutierung von Elongations-, aber auch von RNA 3'-Prozessierungsfaktoren koordiniert.
