Wild boar meat infested with foodborne parasites such as the nematode species Trichinella can cause human disease through consumption of raw or insufficiently cooked meat or meat products. For this reason, the Implementing Regulation (EU) No. 2015/1375 makes official Trichinella inspection mandatory for wild boars and other susceptible species intended for human consumption. During these examinations, larval nematodes other than Trichinella spp. as well as mesocercariae of the trematode Alaria (A.) alata appeared as incidental findings in wild boar meat in the past few years in Germany and Europe. Amongst the broad spectrum of nematodes other than Trichinella spp. incidentally found during mandatory Trichinella testing, non-zoonotic and potentially zoonotic helminths can be identified. At the beginning of this thesis, a universal method for detection of a wide variety of larval nematodes different from the Trichinella genus was not available. Therefore, the first study of this thesis targeted the development of a standardized method based on both morphological examination and molecular analysis for a reliable identification of a multitude of larval nematodes found during official Trichinella inspection. The first step of this approach is based on either the microscopic examination by morphological criteria or the performance of an 18S PCR in order to classify the unknown nematodes towards a taxonomic group such as the families Ascaridae, Toxocaridae and Metastrongylida or the order Strongylida and Rhabditida. After this first classification, a specific PCR targeting genes such as ITS2, cox I or 28S needs to be performed in order to identify the species of the unknown nematodes. Also, it was found that the 18S PCR allows not only for the classification of unknown nematode larvae, but also for the identification of larval trematodes such as A. alata mesocercariae (AM), where the focus of this thesis lies on. As data on the prevalence of AM in wild boars from Germany are scarce, the second aim of this work was to conduct a prevalence study on AM in wild boars from the German federal state of Brandenburg to obtain long-term prevalence data and better evaluate temporal and spatial variations in this area over a longer period of time. In this survey, a total AM prevalence of 28.3% (100/354) was observed among all sampled wild boars. The AM prevalences in the examined counties ranged from 11.5% (3/26) to 64.1% (25/39). In one county, no AM (0/16) were found. Further, the parasite load ranged from zero to 908 AM per animal. In total, the mean parasite load was 9.60 AM per animal which varied widely between the AM positive counties from 0.23 AM per animal to 62.18 AM per animal. Further, a statistically significant correlation between prevalence and age group of the sampled wild boars was observed (p=0.001). Here, the AM prevalence increased with age. To date, AM found during official Trichinella inspection are initially identified by morphological examination using the stereomicroscope. This preliminary diagnosis is currently confirmed by the Alaria spp.-specific PCR which, however, is quite time-consuming, labor-intensive and expensive. Therefore, in the third study of this thesis, a standardized MALDI-TOF-based method for a rapid and reliable identification of AM in wild boar meat was developed. First, a MALDI-TOF protein extraction protocol based on the use of ten AM was designed. This protocol allowed for the generation of high-quality single spectra which were used for creation of main spectra profiles (MSPs). Finally, a total of 61 MSPs representing one host individual each were stored in a newly created AM-specific reference spectra database. Further, this newly established protein extraction protocol was optimized for the use of one single A. alata mesocercaria, which enables application in routine diagnostic laboratories.The next step will be to adapt this MALDI-TOF assay for identification of a broad spectrum of larval helminths found during mandatory Trichinella testing, which further will improve the data situation regarding the occurrence and diversity of parasites in wild boar meat in the long term. In conclusion, all three publications presented in this thesis contribute to improve the data situation concerning helminthic parasites incidentally found during official Trichinella examination.
Wildschweinfleisch, welches mit Lebensmittel-assoziierten Parasiten wie der Nematoden-Spezies Trichinella befallen ist, kann durch den Verzehr von rohem oder unzureichend erhitztem Fleisch oder Fleischprodukten Erkrankungen beim Menschen hervorrufen. Aus diesem Grund schreibt die Durchführungsverordnung (EU) Nr. 2015/1375 die amtliche Untersuchung auf Trichinellen für Wildschweine und andere empfängliche Tierarten vor, deren Fleisch für den menschlichen Verzehr bestimmt ist. Bei diesen obligatorischen Untersuchungen wurden in den letzten Jahren in Deutschland und Europa neben Trichinellen auch andere larvale Nematoden sowie Mesozerkarien des Trematoden Alaria (A.) alata, welche auch als Duncker’scher Muskelegel (DME) bezeichnet werden, als Zufallsfunde in Wildschweinfleisch detektiert. Inmitten des breiten Spektrums dieser Zufallsfunde können sowohl nicht-zoonotische als auch potenziell zoonotische Helminthen identifiziert werden. Zu Beginn dieser Arbeit existierte keine universelle Methode zur Identifizierung einer Vielzahl von larvalen Nematoden, die nicht dem Genus Trichinella angehören. Daher zielte die erste Studie dieser Arbeit auf die Entwicklung einer standardisierten Methode ab, die sowohl auf einer morphologischen Untersuchung als auch auf einer molekularen Analyse basiert und eine zuverlässige Identifizierung einer Vielzahl von larvalen Nematoden ermöglicht, die im Rahmen der amtlichen Untersuchung auf Trichinellen als Zufallsfunde detektiert werden. Der erste Schritt dieser Methode basiert entweder auf der mikroskopischen Untersuchung nach morphologischen Kriterien oder der Durchführung einer 18S PCR, um die unbekannten Nematoden einer taxonomischen Gruppe wie den Familien Ascaridae, Toxocaridae und Metastrongylida oder der Ordnung Strongylida und Rhabditida zuzuordnen. Nach dieser ersten Klassifizierung wird zur Speziesidentifizierung eine spezifische PCR zum gezielten Nachweis von Genen wie ITS2, cox I oder 28S durchgeführt. Die im ersten Schritt dieser universellen Methode beschriebene 18S PCR ist zudem nicht nur für die Klassifizierung unbekannter Nematoden-Larven geeignet, sondern sie ermöglicht auch die Identifizierung larvaler Trematoden wie dem DME, auf dem der Fokus dieser Dissertation liegt. Da bislang nur wenige Daten zur DME-Prävalenz bei Wildschweinen in Deutschland verfügbar sind, bestand das zweite Ziel dieser Arbeit darin, eine Prävalenzstudie zum DME bei Wildschweinen im Bundesland Brandenburg durchzuführen, um langfristige Prävalenzdaten zu erhalten sowie zeitliche und räumliche Schwankungen in dieser Region über einen längeren Zeitraum besser bewerten zu können. In dieser Studie wurde unter allen beprobten Wildschweinen eine DMEGesamtprävalenz von 28,3% (100/354) beobachtet. Die ermittelten Prävalenzen lagen zwischen 11,5% (3/26) und 64,1% (25/39) in den untersuchten DME-positiven Landkreisen, während in einem Landkreis keine DME (0/16) detektiert wurden. Weiterhin schwankte die Parasitenbelastung zwischen null und 908 DME pro Tier. Insgesamt lag die mittlere Parasitenbelastung bei 9,60 DME pro Tier, wobei die Werte in den DME-positiven Landkreisen stark variierten (zwischen 0,23 DME und 62,18 DME pro Tier). Außerdem wurde eine statistisch signifikante Korrelation zwischen der Prävalenz und der Altersklasse der beprobten Wildschweine festgestellt (p=0,001). Hier nahm die DME-Prävalenz mit dem Alter zu. Bislang werden DME, die im Rahmen der amtlichen Untersuchung auf Trichinellen detektiert werden, zunächst durch die morphologische Untersuchung mittels Stereomikroskop identifiziert. Diese vorläufige Diagnose wird derzeit durch die Alaria spp.-spezifische PCR bestätigt, welche jedoch recht zeitaufwendig, arbeitsintensiv und mit entsprechenden Kosten verbunden ist. Daher wurde in der dritten Studie dieser Arbeit eine standardisierte, MALDI-TOF-basierte Methode für eine schnelle und zuverlässige Identifizierung von DME in Wildschweinfleisch etabliert. Zunächst wurde ein MALDI-TOF-Proteinextraktionsprotokoll entwickelt, welches auf der Verwendung von zehn DME basiert. Dieses Protokoll ermöglichte die Erzeugung hochwertiger Einzelspektren, die für die Erstellung von Referenzspektren, sogenannten Main Spectra Profiles (MSPs), herangezogen wurden. Schließlich wurden insgesamt 61 MSPs, welche jeweils ein Wirtstierindividuum repräsentieren, in einer neu erstellten DMEspezifischen Referenzspektren-Datenbank hinterlegt, die diagnostischen Routinelaboren zur Verfügung gestellt werden kann. Darüber hinaus wurde dieses neu entwickelte Proteinextraktionsprotokoll für den Einsatz eines einzigen DME optimiert, was die Anwendung in diagnostischen Routinelaboratorien ermöglicht. Im nächsten Schritt soll diese MALDI-TOF-basierte Methode dahingehend adaptiert werden, dass dadurch die Identifizierung eines breiten Spektrums an larvalen Helminthen, welche bei der amtlichen Untersuchung auf Trichinellen detektiert werden, ermöglicht wird. Dies wiederum wird langfristig die Datenlage hinsichtlich des Vorkommens und der Vielfalt von Parasiten in Wildschweinfleisch verbessern. Zusammenfassend betrachtet leisten alle drei Publikationen, die in dieser Doktorarbeit vorgestellt wurden, einen wertvollen Beitrag zur Verbesserung der Datenlage in Bezug auf Helminthen, welche im Rahmen der amtlichen Untersuchung auf Trichinellen als Zufallsfunde detektiert werden.
