Diabetes mellitus Typ 2 ist eine Stoffwechselerkrankung, die unbehandelt durch die verminderte Insulinwirkung im Körper und der einhergehenden, chronischen Hyperglykämie zu einer Vielzahl weiterer Erkrankungen und schwerer Komplikationen führen kann, unter denen die Lebensqualität der Patienten leidet. Weltweit hat sich im Jahr 2014 die Prävalenz der Stoffwechselstörung verglichen mit Anfang der 80-iger Jahre von 4,7% auf 8,5% der erwachsenen Bevölkerung verdoppelt. Die jährlichen, globalen Gesundheitsausgaben betragen schätzungsweise 827 Milliarden US$. Bei der Entwicklung der Erkrankung sind Übergewicht und Adipositas entscheidende Risikofaktoren. Durch Veränderungen des Lebensstils, vor allem durch mehr körperliche Aktivität und eine gesunde Ernährung, kann dem Entstehen und dem Fortschreiten der Stoffwechselstörung durch den Patienten aktiv vorgebeugt werden, was vielen Menschen schwerfällt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde daher der Fokus auf die Modellierung der Energieaufnahme des Körpers durch Hemmung intestinaler Transporter von Monosacchariden und langkettigen Fettsäuren mithilfe von ausgewählten pflanzlichen Extrakten gelegt. Die in-vitro-Studien wurden in Caco-2-Zellen durchgeführt, die für die Experimente geeignet erschienen. Bei den Zellen handelt es sich um eine Kolon-Adenokarzinom-Zelllinie, die spontan innerhalb von 15-21 Tagen nach Zellkonfluenz morphologische Merkmale von epithelialen Dünndarmzellen ausbildet, wie z. B. eine Bürstensaummembran mit Enzymen und Transportern. Um optimale Bedingungen für Studien zur Aufnahmehemmung zu schaffen, ist das Caco-2-Modell genauer charakterisiert worden. Anhand von Ergebnissen aus dem Western-Blot wurde die Expression intestinaler Haupttransporter der untersuchten Substrate, insbesondere des Glucose-Transporters SGLT-1, des Glucose- und Fructose-Transporters GLUT-2 des Fructose-Transporters GLUT-5 sowie der Fettsäure-Transporter FATP-2 und FATP-4, über 15-21 Tage nachgewiesen. Die Funktionalität der Transporter wurde über die Substrataufnahme mit 3H-(Tritium-) markierter Glucose, Fructose und Palmitinsäure über 15-21 Tage gemessen. Durch die Beobachtungen von Expression und Funktionalität von Transportern in Caco-2-Zellen konnte ein qualitativer, jedoch kein quantitativer Zusammenhang festgestellt werden. Für die Charakterisierung des Modells wurden weitere Experimente zur Kinetik und passiven Diffusion durchgeführt. Während die Untersuchungen mit bekannten Inhibitoren die Etablierung und Eignung des Zell-Assays für Aufnahmestudien mit radioaktiv markierter Glucose und Fructose bestätigten, führte die Zugabe des FATP-2-Inhibitors Lipofermata, selbst unter verschiedenen, experimentellen Bedingungen, zu keiner Hemmung der Palmitinsäure-Aufnahme. Auch beim späteren Screening ausgewählter, pflanzlicher Extrakte konnte kein Effekt gemessen werden. Möglicherweise besitzt der FATP-2 im Caco-2-Zellmodell nur eine untergeordnete Rolle bei der Fettsäure-Aufnahme oder Hemmungen werden durch passive Diffusionsvorgänge aufgrund des lipophilen Charakters des Substrats kompensiert. Die vorliegenden Ergebnisse zeigten, dass die Reduzierung der intestinalen Aufnahme von langkettigen Fettsäuren durch Transporter-Hemmung kritisch zu betrachten ist. Für die Experimente zur Aufnahmehemmung intestinaler Glucose-Transporter wurden 38 Pflanzen ausgewählt, deren Zubereitungen traditionell bei Diabetes mellitus z. T. bis heute verabreicht werden und/oder die im Tierexperiment bzw. in Studien mit Menschen antidiabetische Effekte zeigten. Die methanolischen und wässrigen Extrakte der Pflanzen wurden im Caco-2-Zell-Assay getestet. Im Ergebnis des Screenings wurde eine signifikant verringerte Glucose-Aufnahme durch neun methanolische Extrakte aus den Früchten von Aronia melanocarpa, Lycium chinense, Vaccinium myrtillus, Cornus officinalis und Crataegus pinnatifida, aus den Blättern von Peumus boldus, Juglans regia und Brassica oleraceae var. capitata f. alba, sowie aus der Wurzel von Adenophora triphylla bestimmt. Die zwei methanolischen Extrakte aus den Blättern von Peumus boldus und Juglans regia hemmten neben der Aufnahme von Glucose zusätzlich die Aufnahme von Fructose in Caco-2-Zellen. Die zwei wässrigen Extrakte aus der Fruchtschale von Malus domestica ‘Golden Delicious’ und aus der Rinde von Eucommia ulmoides hemmten ebenfalls die Aufnahme von Glucose. Der methanolische Extrakte aus den Blättern des Weißkohls (Brassica oleraceae var. capitata L. f. alba) wies mit einer Reduzierung der Glucose-Aufnahme um 82,8% die stärkste Hemmung auf. Nach der phytochemischen Untersuchung unter Verwendung von HPLC und LC-MS zeigte sich, dass im Extrakt Hexosen in hoher Konzentration enthalten waren, die vermutlich durch Verschiebung des Verhältnisses von radioaktiver zu nicht-radioaktiver Glucose eine Pseudohemmung bei ihrer Aufnahme erzeugen, was bei ähnlichen Experimenten in der Literatur bisher übersehen wurde. Trotz dieses Effekts kann ein Teil der Hemmung durchaus auf eine Interaktion weiterer Inhaltsstoffe des Weißkohls mit den intestinalen Transportern zurückgeführt werden. Bei vorausgegangenen Experimenten aus der Literatur und im Rahmen dieser Arbeit wurden isolierte sekundäre Pflanzenstoffe getestet, die zum Spektrum der Inhaltsstoffe in Kohlarten gehören. Dabei wurden Hemmungen der Glucose- und Fructose-Aufnahme festgestellt.
Diabetes mellitus type 2 is a metabolic disorder, which, if left untreated, can lead to chronical hyperglycemia, comorbidities and severe complications caused by a reduced action of insulin. Commonly, patients suffer from an impaired life quality. Since 1980, the prevalence of the disease increased from 4.7% to 8.5% of the adult population in 2014. Based on cost estimates, the direct annual costs of Diabetes amounts to US$ 827 billion to the world. Obesity and adipositas play a key role in the development of Diabetes mellitus type 2. People can prevent the occurrence and progress of the metabolic disorder actively by alterations in their lifestyle, specifically with more physical activity and a healthy diet, which is difficult to achieve for many people. Therefore, the present work focused on the modulation of energy intake due to an inhibition of intestinal transporters of monosaccharides and long-chain fatty acids by selected plant extracts. The in vitro studies were performed in Caco-2 cells, which appeared as suitable for the experiments. These cells were derived from a colon adenocarcinoma and differentiate spontaneously within 15-21 days after confluence into epithelial enterocytes with their typical morphological characteristics, such as a brush border membrane with enzymes and transporters. In order to choose optimal settings to study uptake inhibition, the Caco-2 model was characterized more precisely. The expression of the intestinal main transporters of the investigated substrates, specifically the glucose transporter SGLT-1, the glucose and fructose transporter GLUT-2, the fructose transporter GLUT-5 and the fatty acid transporters FATP-2 and FATP-4 was determined by Western blot over 15-21 days after confluence. The functionality of the transporters was proven by measuring the uptake of 3H-(tritium) labeled glucose, fructose and palmitic acid over 15-21 days as well. According to the results, the expression and functionality of transport proteins show a qualitative, but not a quantitative relation. Other studies were performed calculating kinetics and passive diffusion for further characterization of the intestinal barrier model. Whereas the experiments with prominent inhibitors confirmed the establishment and suitability of the cell assay to perform uptake studies with radiolabeled glucose and fructose, the FATP-2 inhibitor lipofermata did not decrease the uptake of palmitic acid in Caco-2 cells using different settings. Furthermore, the plant extracts, which were screened, did not show any inhibitory effects on uptake of palmitic acid. Possibly, the FATP-2 plays a subordinated role in the Caco-2 cell model regarding the long-chain fatty acid uptake or inhibitions of the uptake of palmitic acid were compensated by passive diffusion due to the lipophilic character of the substrate. The results imply a critical assessment of the uptake inhibition of long-chain fatty acids by transporters as a therapy option. For uptake studies, 38 plants, whose preparations has been traditionally used to treat Diabetes mellitus type 2 and/or showed anti-diabetic effects in animal or human studies, were chosen to investigate uptake inhibition of intestinal transporters. The methanolic and aqueous extracts of the plants were tested in the Caco-2 cell assay. The nine methanolic extracts made from the fruits of Aronia melanocarpa, Lycium chinense, Vaccinium myrtillus, Cornus officinalis, Crataegus pinnatifida, from the leaves of Peumus boldus, Juglans regia and Brassica oleraceae var. capitata f. alba as well as the extract made from the roots of Adenophora triphylla decreased the glucose uptake significantly according to the results of the screening. Furthermore, the two methanolic extracts made from the leaves of Peumus boldus and Juglans regia reduced fructose uptake in Caco-2 cells as well. The two aqueous extracts made from the fruit peel of Malus domestica ‘Golden Delicious’ and from the bark of Eucommia ulmoides decreased the glucose uptake. The methanolic extract of white cabbage (Brassica oleraceae var. capitata L. f. alba) showed reduced glucose uptake by 82.8%, which was the highest inhibition compared to other extracts. After phytochemical analysis by using HPLC and LC-MS, hexoses were determined in a sufficient amount to interfere with the measurement. Regarding the uptake studies, the shift of the relation between radioactive and non-radioactive glucose can generate a pseudo inhibition, which was overlooked in similar experiments in literature as yet. Despite this effect, a part of the inhibition can be caused by the constituents as some of the isolated, secondary plant metabolites contained in cabbage species, showed inhibitory activity on glucose and fructose uptake when tested in cell assays according to results in literature as well as in the present work.
