The field of optogenetics is in constant development while searching for new optogenetic tools that can be used to control nerve cells, stimulus and optical control of neuronal activity. Among the candidates to be developed as new optogenetics tools, are the LOV (Light Oxygen Voltage) proteins which are ubiquitous photosensors in all domains of life. Channelrhodopsins are frequently used in optogenetics due to their light-gated cation activity, which is a unique characteristic among the ion channels.
Channelrhodopsin-1 from Chlamydomonas augustae (CaChR1) exhibits slower inactivation under continuous illumination and a shift in the visible maximum absorption compared to Channelrhodopsin-1 and Channelrhodopsin-2 from Chlamydomonas reinhardtii. These features are advantageous when developing optogenetic tools, securing CaChR1 as a viable candidate for research. Here, by variation of amino acid chains, an investigation of the molecular changes in the photocycle of CaChR1 was conducted. Steady-state and time-resolved molecular spectroscopy revealed the unusual deprotonated cysteine amino acid (C174) in the ground state. It was also established that C174 plays a central role as the internal proton donor to the retinal Schiff base during the decay of the P2380 intermediate state, which is concomitant with the deprotonation of D299 and protonation of E136 and E169 amino acids.
Among the LOV domains an investigation on a variant of the short LOV protein from Dinoroseobacter shibae was conducted. The DsLOV-M49S has the advantage of having an exceptionally fast photocycle compared to other LOV domains. This unique feature of DsLOV-M49S enables the performance of time-resolved molecular spectroscopy and the characterization of the thio-adduct state’s formation. Using an infrared quantum cascade laser (QCL), the evolution of the weak changes in absorption were successfully tracked for the S-H vibration of a single cysteine residue. The changes indicate the deprotonation of C72 with a time constant of 12 µs, which coincides with the formation of the FMN-cystenyl-thiol-adduct state.
This thesis focuses on a deep biophysical mechanistic investigation of these two systems candidates to optogenetic tools. The experiments performed elucidate the choreographed sequence of proton transfers, changes in electron densities, spin alterations, and transient bond formations and breakages; all of which supplement and refine the mechanistic interpretation of the light-induced structural changes in LOV domains and CaChR1.
Das Gebiet der Optogenetik befindet sich in ständiger Entwicklung bei der Suche nach neuen optogenetischen Werkzeugen, die zur Steuerung von Nervenzellen, Stimuli und optischer Kontrolle neuronaler Aktivität verwendet werden können. Zu den Kandidaten, die als neue optogenetische Werkzeuge entwickelt werden sollen, gehören die LOV-Proteine (Light Oxygen Voltage), welche ubiquitäre Photosensoren in allen Bereichen des Lebens sind. Channelrhodopsine werden aufgrund ihrer lichtgesteuerten Kationenaktivität, die ein Alleinstellungsmerkmal unter den Ionenkanälen ist, häufig in der Optogenetik eingesetzt.
Channelrhodopsin-1 aus Chlamydomonas augustae (CaChR1) zeigt eine langsamere Inaktivierung unter kontinuierlicher Beleuchtung und eine Verschiebung des sichtbaren Absorptionsmaximums im Vergleich zu Channelrhodopsin-1 und Channelrhodopsin-2 aus Chlamydomonas reinhardtii. Diese Eigenschaften sind vorteilhaft bei der Entwicklung optogenetischer Werkzeuge und machen CaChR1 zum Gegenstand aktuellen Forschung. Hier wurde durch Variation einzelner Aminosäuren eine Untersuchung der molekularen Veränderungen in dem Photozyklus von CaChR1 durchgeführt. Statische und zeitaufgelöste Molekülspektroskopie zeigte den ungewöhnlichen Deprotonierungszustand einer Cystein-Aminosäure (C174) im Grundzustand. Es wurde auch festgestellt, dass C174 eine zentrale Rolle als interner Protonendonor der Retinal-Schiff-Base während des Zerfalls des P2380-Intermediats spielt, der mit der Deprotonierung von D299 und der Protonierung der Aminosäuren E136 und E169 einhergeht.
Unter den LOV-Domänen wurde eine Variante des kurzen LOV-Proteins aus Dinoroseobacter shibae untersucht. DsLOV-M49S hat den Vorteil, dass es im Vergleich zu anderen LOV-Domänen einen außergewöhnlich schnellen Photozyklus aufweist. Diese einzigartige Eigenschaft von DsLOV-M49S ermöglicht die Durchführung zeitaufgelöster Molekülspektroskopie und die Charakterisierung der Bildung des Thio-Addukt-Zustands. Unter Verwendung eines Infrarot-Quantenkaskadenlasers (QCL) wurden schwache Absorptionsänderungen der S-H-Schwingung eines einzelnen Cystein-Restes erfolgreich verfolgt. Die Änderungen weisen auf die Deprotonierung von C72 mit einer Zeitkon-stante von 12 µs hin, die mit der Bildung des FMN-Cystenyl-Thiol-Adduktzustandes zusammenfällt.
Diese Arbeit konzentriert sich auf eine tiefgreifende biophysikalisch-mechanistische Untersuchung dieser beiden Systeme und evaluiert diese als optogenetische Werkzeuge. Die durchgeführten Experimente klären die choreografierte Abfolge von Protonentransfers, Änderungen der Elektronendichte, Spin-Veränderungen und transiente Bindungs-bildungen und -brüche auf; all dies ergänzt die mechanistische Interpretation der lichtinduzierten strukturellen Veränderungen in LOV-Domänen und CaChR1.
