The astonishing cellular diversity and finely tuned neuroanatomy of the cerebral cortex motivates sustained research efforts on the mechanisms that give rise to this intricate tissue. To enable the higher cognitive functions of mammals, various subtypes of cortical projection neurons, distributed in precise ratios and at specific positions in the cortex, participate in the neuronal circuitry of the brain. These positions and ratios are established during embryonic development. Including the neuron’s targets and input sources, the subtype identity of a neuron depends on its transcriptomic signature.
Broadly speaking, cortical neuron subtypes project either to the contralateral hemisphere, such as callosal projection neurons (CPN) or outside of the cortex, such as corticofugal projection neurons (CFuPN). Both of these subtypes are generated by neural progenitor cells (NPCs) in the forebrain. During embryonic development, NPCs divide sequentially to generate other NPCs and various neuron subtypes, as dictated by the identity of the NPC itself. The fate decisions of an NPC lineage that determine how many neurons of each subtype it will produce are influenced by a spatially and temporally specified combination of molecular signals. These intra- and extracellular cues jointly intervene in cellular mechanisms, such as division speed, inheritance of fate-determining factors, and many more, ultimately shaping the ratio of neuron subtypes that the lineage produces during differentiation.
One of the mechanisms that can control differentiation is the alternative splicing (AS) of primary transcripts, which can be regulated in a cell type- and stage-specific manner, ensuring adaptation to changing developmental requirements. AS is a way of generating molecular diversity by the context-dependent inclusion or exclusion of exons, introns or parts of exons from pre-mRNAs to form distinct mRNAs. At its simplest, AS is regulated by distinct sequence elements in the pre-mRNA, which are bound by splicing-regulatory proteins, termed splicing factors (SFs). SFs themselves respond to intra- and extracellular cues by being expressed or activated according to the needs of the developing tissue. Examples of AS regulating cell differentiation in other biological systems abound, but, even though AS is implicated in an increasing number of processes in the adult brain, its functions in cortex development are largely unexplored.
The focus of this work are two isoforms of the neurotrophin-3 receptor, TrkC, which result from alternative splicing. The better studied of the two isoforms, the kinase-active TrkC-TK+, has been shown to act as a recipient of survival signals in neurons. Our reseach group previously showed that the less studied isoform, TrkC-T1, is a determinant of CFuPN fate, present in the development of the cortex in specific cell types and time windows. As the levels of TrkC-T1 in NPCs coordinate the numbers of CFuPN that are produced at the expense of CPN, the aim of this project was to explore how the AS of TrkC is regulated, in order to further our understanding of the factors that shape the NPC transcriptome and hence fate.
In this work, we show that the balance between TrkC-T1 and TrkC-TK+ is cell type-specific in the developing cortex and primarily established at the level of AS regulation. We find that the splicing factors Srsf1 and Elavl1 regulate this isoform balance in an antagonistic manner. To our knowledge, this is the first described instance of these splicing factors co-regulating an AS event. In addition to this, we bring direct in vivo evidence that implicates both of these SFs in the CFuPN-CPN fate choice, a biological process they had not been previously linked to. We also find that Srsf1 and Elavl1 have different expression patterns in the developing cortex, a feature that contributes to the different cell type-specific splicing-regulatory environments that give rise to distinct ratios of TrkC-T1 to TrkC-TK+. Taken together, these findings further our knowledge of how cortical projection neuron fate is regulated at the posttranscriptional level.
Die außerordentliche Vielfalt an Zellen und die präzise Neuroanatomie der Großhirnrinde (Kortex) führt immer wieder zu neuen Forschungsbemühungen, um die Mechanismen zu verstehen, welche diese komplexe Gewebeorganisation hervorbringen. Um die höheren kognitiven Funktionen der Säugetiere zu ermöglichen, beteiligen sich diverse Untertypen von kortikalen Neuronen an neuronalen Netzwerken, in präzise abgestimmten Verhältnissen und an definierten Positionen. Diese Verhältnisse und Positionen werden während der Embryonalentwicklung festgelegt. Zusammen mit den Zielzellen und Input-Quellen eines Neurons hängen diese Eigenschaften von dessen transkriptomischen Signatur ab.
Im Allgemeinen projizieren die Untertypen von kortikalen Neuronen entweder zur gegenüberliegenden Kortexhämisphäre, wie zB. callosale Projektionsneurone (CPN), oder außerhalb des Kortex, wie z.B. kortikofugale Projektionsneurone (CFuPN). Beide Untertypen werden von neuralen Vorgängerzellen (engl. “neural progenitor cells”, kurz NPCs) im Vorderhirn generiert. Während der Embryonalentwicklung teilen sich die NPCs sequentiell, um andere NPCs oder unterschiedliche Neuron-Untertypen zu generieren, so, wie es die Identität der NPC an sich bestimmt. Die Schiksalsentscheidungen einer NPC-Abstammungslinie werden von einer zeitlich und räumlich bestimmten Kombination an molekularen Signalen bestimmt. Diese intra- und extrazelluläre Auslöser greifen gemeinsam in zelluläre Mechanismen ein, wie die Teilungsgeschwindigkeit, Vererbung von schicksalsbestimmenden Faktoren u.v.m., um letztlich das Verhältnis der Neuron-Untertypen zu bestimmen, welche die Abstammungslinie während der Differenzierung produziert.
Eines der Mechanismen, welche zelluläre Differenzierung beeinflussen können, ist das alternative Spleißen (AS) der Primärtranskripte, welches basierend auf dem Zelltyp oder Entwicklungsstadium reguliert werden kann, um die Anpassung an sich verändernden Entwicklungsanforderungen zu ermöglichen. AS generiert molekulare Diversität durch die kontextabhängige Inklusion oder Exklusion von Exone, Introne oder Teile von Exone der Prä-mRNA, um unterschiedliche mRNAs hervorzubringen. In der einfachsten Form wird AS von Sequenzelementen reguliert, die von spleiß-regulierenden Proteinen, genannt Spleißfaktoren (SFs) gebunden werden. SFs reagieren an sich auf intra- und extrazelluläre Reize, indem sie unterschiedlich exprimiert oder aktiviert werden, so, wie das sich entwickelnde Gewebe es benötigt. Es gibt viele Beispiele von AS-geregelten Zelldifferenzierung aus anderen biologischen Systemen. Trotz der Tatsache, dass AS mit einer steigenden Zahl an Prozessen des adulten Gehirns in Verbindung gebracht wird, sind dessen Funktionen im sich entwickelnden Kortex größtenteils unerforscht.
Der Fokus dieser Arbeit stellen zwei Isoformen des Neurotrophin-3-Rezeptors TrkC dar, welche aus AS resultieren. Die umfangreich studierte Isoform, die Kinase-aktive TrkC-TK+ Isoform, wurde mit dem Empfangen von Überlebenssignale in Neuronen in Verbindung gebracht. Unsere Forschungsgruppe hat gezeigt, dass die weniger bekannte Isoform, TrkC-T1, ein bestimmender Faktor für das CFuPN-Schiskal ist. Sie ist in dem sich entwickelnden Kortex in genau definierten Entwicklungszeiträumen und Zelltypen vertreten. Da die Niveaus an TrkC-T1 in NPCs die Anzahl prodzierten CFuPN, im Gegenzug zu CPN, bestimmen, war das Ziel dieser Arbeit zu erforschen, wie das AS von TrkC geregelt ist, um unser Wissen über Faktoren zu erweitern, welche das NPC-Transkriptom und damit deren Schicksal gestalten.
In dieser Arbeit zeigen wir, dass die Balance zwischen TrkC-T1 und TrkC-TK+ zelltypspezifisch im sich entwickelnden Kortex ist, und dass dies primär auf der Ebene der AS-Regulation bestimmt wird. Wir beschreiben, dass die SF Srsf1 und Elavl1 diese Isoform-Balance auf antagonistischer Art und Weise regeln. Nach bestem Wissen ist das die erste beschriebene ko-regulierende Interaktion dieser Faktoren. Zusätzlich erbringen wir direkte in vivo-Evidenz, dass die beiden SFs an der CFuPN-CPN-Schiksalentscheidung beteiligt sind, ein biologischer Prozess, mit dem sie bislang nicht in Verbindung gebracht worden sind. Außerdem beschreiben wir, dass Srsf1 und Elavl1 unterschiedliche Expressionsmuster im sich entwickelnden Kortex aufweisen, was zur zelltypspezifischen Balance von TrkC-T1 zu TrkC-TK+ beiträgt. Zusammengenommen erweitern diese Befunde unser Wissen über wie das Schicksal kortikaler Neurone auf dem posttranskriptionellen Niveau geregelt ist.
