Glycans are among the fundamental building blocks of life on Earth, essential to all known living organisms. They play key roles in a variety of biological processes, and contribute significantly to the extraordinary molecular and functional diversity of cells. As the importance of glycans has gradually been recognized, earning them the well-deserved attention of the scientific community, the lack of a high-throughput, de novo sequencing method has become a major obstacle in glycosciences, preventing the field from reaching its full potential. Although the invention of soft ionization methods gave enormous impetus for mass spectrometry-based glycan analysis, conventional fragmentation techniques often fail to distinguish isomeric carbohydrates or provide unambiguous structural assignment.
With the prospect of overcoming these limitations, this thesis aims to expand the mass spectrometry-based toolbox for glycan analysis and go beyond simply weighing sugars. Through the combination of mass spectrometry with orthogonal methods suitable to study ions transferred into the gas phase, we try to reveal further information about the species underlying the peaks in mass spectra. Coupling mass spectrometry to ion mobility spectrometry – a technique that harnesses electric forces for separating ions in gaseous media – results in a powerful method that provides information not only on the mass and charge, but also on the size and shape of ions. Using the concept of theoretical plates and plate heights, we develop a detailed analytical model that describes three main aspects of ion mobility separations: zone broadening, resolution, and peak capacity. The plate-height model for ion mobility separations was conceived in analogy to existing models of chromatography. As such, it enables the direct comparison of ion mobility spectrometry with other zonal separation methods, and may help to integrate this technique into the unified language of separation science. While our work is mainly theoretical and focuses on the technique rather than on specific molecules, the utility of the plate-height model to aid glycan analysis in everyday practice is demonstrated through a systematic study on fluorescently labeled oligosaccharides.
Santiago Ramón y Cajal warned young investigators against becoming obsessed with theories and instruments to an unhealthy extent, forgetting about nature in natural sciences. To avoid these pitfalls, the second part of this thesis focuses on the most important element of glycomics: the sugars themselves. In particular, we study the structure of glycosaminoglycans, a well-recognizable class of complex carbohydrates with a linear sequence and highly acidic character. As their biosynthesis is not entirely deterministic, the structure of glycosaminoglycans also exhibits random features. Moreover, sulfation of the disaccharide building blocks at various positions, together with potential epimerization of certain residues, lead to a multitude of isomeric sequences. To decipher this complexity, we studied mass-selected glycosaminoglycan ions with infrared action spectroscopy in the cryogenic environment of superfluid He droplets. The recorded infrared spectra revealed details about the structure of deprotonated oligosaccharides that could not have been attained by simple mass measurements, such as the localization of charges or differences in intramolecular hydrogen bonding patterns. In addition, diagnostic spectral features allowed for the unambiguous distinction of glycosaminoglycan stereoisomers with minute structural differences. Finally, the surprisingly strong structure–spectrum correlations observed in the vibrational fingerprints of these ions have potential implications for de novo sequence assignment, providing motivation for future spectroscopic experiments on glycosaminoglycans.
Glykane gehören zu den grundlegenden Bausteinen des Lebens. Sie sind essentiell für eine Vielzahl von biologischen Prozessen und tragen wesentlich zu der außergewöhnlichen molekularen und funktionellen Vielfalt von Zellen bei. Im Laufe der vergangenen Jahrzehnte erhielten Glykane wachsende Aufmerksamkeit vonseiten der wissenschaftlichen Gemeinschaft, nachdem ihre Bedeutung zunehmend anerkannt wurde. Das Fehlen einer universellen Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethode stellt jedoch ein großes Hindernis in der Kohlenhydratforschung dar und verhindert, dass die Glykowissenschaften ihr volles Potenzial entfalten können. Obwohl die Erfindung von “sanften” Ionisationsmethoden der massenspektrometrischen Glykananalyse großen Auftrieb gegeben hat, ermöglichen traditionelle Fragmentierungstechniken oft keine Unterscheidung oder eindeutige Strukturzuordnung von Kohlenhydratisomeren.
Mit der Aussicht, diese Einschränkungen zu überwinden, verfolgt diese Arbeit das Ziel, die massenspektrometriebasierte Glykananalyse zu erweitern und über das einfache Wiegen von Zuckern hinauszugehen. Durch die Kombination von Massenspektrometrie mit orthogonalen Methoden versuchen wir zusätzliche Informationen über die Analyten zu erhalten, die sich hinter den Peaks im Massenspektrum verbergen. Die Kopplung von Massenspektrometrie mit Ionenmobilitätsspektrometrie – eine Technik, die elektrische Kräfte zur Trennung von Ionen in inerten Gasen nutzt – führt zu einer leistungsstarken Methode, die nicht nur Informationen über Masse und Ladung, sondern auch über die Größe und Form der Ionen liefert. Durch Verwendung des Konzepts von Trennstufenzahlen und Trennstufenhöhen entwickeln wir hier ein detailliertes analytisches Modell, um drei Hauptaspekte der Ionenmobilitätstrennungen zu beschreiben: Zonenverbreiterung, Auflösung und Peakkapazität. Dieses Modell für Ionenmobilitätstrennungen wurde in Analogie zu den bestehenden Modellen der Chromatographie konzipiert. Daher ermöglicht es den direkten Vergleich der Ionenmobilitätsspektrometrie mit anderen zonalen Trennmethoden und könnte die Integration von Ionenmobilitätsspektrometrie in das einheitliche System der Trennwissenschaft fördern. Dieser theoretische Teil der Arbeit konzentriert sich auf technische Aspekte, während der praktische Nutzen des Modells durch eine systematische Studie über fluoreszenzmarkierte Glykane demonstriert wird.
Santiago Ramón y Cajal warnte junge Forschende davor, in einem ungesunden Ausmaß von Theorien und Instrumenten besessen zu sein und dabei die Natur in den Naturwissenschaften zu vergessen. Um diese Fallstricke zu vermeiden, fokussiert sich der zweite Teil dieser Arbeit auf das wichtigste Element der Kohlenhydratforschung: die Zucker selbst. Vor allem untersuchen wir die Struktur von Glykosaminoglykanen, einer einzigartigen Klasse komplexer Kohlenhydrate mit linearer Sequenz und stark saurem Charakter. Da ihre Biosynthese nicht völlig deterministisch ist, weist die Struktur der Glykosaminoglykane stochastische Merkmale auf. Darüber hinaus führt die Sulfatierung der Disaccharid-Bausteine und die mögliche Epimerisierung bestimmter Reste zu einer Vielzahl isomerer Sequenzen. Um diese Komplexität zu entschlüsseln, haben wir massenselektierte Glykosaminoglykan Ionen mit Infrarotspektroskopie in der kryogenen Umgebung suprafluider Heliumtröpfchen untersucht. Die Infrarotspektren enthüllten Details über die Struktur der deprotonierten Oligosaccharide, die durch bloße Massenspektrometrie verborgen blieben. Solche Informationen sind zum Beispiel die Lokalisierung von Ladungen oder Unterschiede in den intramolekularen Wasserstoffbrückenbindungen. Die diagnostischen Spektralbanden ermöglichten auch die eindeutige Unterscheidung von Stereoisomeren mit minimalen strukturellen Unterschieden. Schließlich könnten die büerraschend starken Struktur–Spektrum Korrelationen, die in den spektroskopischen Fingerabdrücken dieser Ionen beobachtet wurden, potentielle Auswirkungen auf die Sequenzierung von Glykosaminoglykanen haben und daher zukünftige spektroskopische Experimente an diesen Biomolekülen vorantreiben.
