Spektroskopische und kinetische Untersuchungen der Photokonversion der bakteriellen Phytochrome Agp1 aus Agrobacterium tumefaciens und Ppr aus Rhodospirillum centenum

Abstract

Phytochrome sind Photorezeptoren bei denen rotes bzw. dunkelrotes Licht die Konversion zwischen dem Rotlichtabsorbierenden Pr-Zustand und dem Dunkelrotlicht-absorbierenden Pfr-Zustand induziert. Die Photokonversion wird durch die Z/E Isomerisierung der 15,16-Doppelbindung des Bilin-Chromophor eingeleitet und führt in mehreren Schritten zu einer Strukturänderung des Proteins. In dieser Arbeit wurde die Kinetik der Photokonversion nach Anregung des Pr Zustandes der Biliverdin-Addukte von Agp1 aus Agrobacterium tumefaciens und Ppr aus Rhodospirillum centenum mittels Blitzlichtspektroskopie untersucht. Ppr ist ein Hybrid aus den beiden Photorezeptoren PYP und Phytochrom. Nach Anregung der Phytochrom-Domäne kommt es bei Ppr nicht zur Pfr-Bildung, obwohl alle dafür bekannten Regionen und Aminosäuren in der Sequenz von Ppr vorliegen. Weiterhin wurde die Abhängigkeit der Photokonversion der Phytochrom-Domäne von Ppr vom spektralen Zustand der PYP- Domäne untersucht. Bei Agp1 wurden bei der Photokonversion, wie bei pflanzlichem Phytochrom, drei Intermediate durchlaufen, die mit Lumi-R, Meta- Ra und Meta-Rc bezeichnet wurden. Die Untersuchung von verschieden großen Fragmenten ergab, dass die Histidin-Kinase keinen Einfluss auf die Photokonversion hat, und dass die PHY-Domäne essentiell für die Pfr-Bildung ist. Die Entfernung der Aminosäuren 2-19 von Agp1 (Δ18N) verhindert zwar die kovalente Bindung des Chromophors, die photochromen Eigenschaften werden jedoch nur geringfügig beeinflusst. Weiterhin konnte durch H/D-Isotopenaustausch und Untersuchung der pH-Abhängigkeit der Kinetik gezeigt werden, dass die Photokonversion mehrere Protonentransferschritte einschließt. Mit einem pH-Indikator wurde nachgewiesen, dass es zu einer transienten Protonenabgabe und einer partiellen -wiederaufnahme während der Photokonversion kommt. An diesen Protonentransferschritten könnten die beiden konservierten Aminosäuren D197 und H250 beteiligt sein, deren Substitution zu einer Verringerung des pKa-Wertes des protonierten Chromophors und einer Inhibierung der Pfr-Bildung führt. Durch Verwendung des in der 5Zs Geometrie arretierten Chromophors konnte gezeigt werden, dass die Pr nach Pfr- Photokonversion mit einer Strukturänderung der A/B-Methinbrücke verbunden ist, die sich während des Meta-Ra nach Meta-Rc Überganges vollzieht. Die kinetischen Untersuchungen verschiedener Bilin-Addukte von Agp1 zeigen, dass die geringere Flexibilität der C18 Vinylgruppe in Biliverdin zu einer Verlangsamung der Pfr-Bildung führt. Durch CD-Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass der Chromophor im Pr-Zustand von Agp1 dieselbe Chiralität wie bei allen anderen Phytochromen besitzt. Bei der Photokonversion nach Pfr kommt es bei den meisten Phytochromen zu einem Vorzeichenwechsel der Elliptizität der Banden. Der fehlende Vorzeichenwechsel in den CD-Spektren des Biliverdin- Adduktes von Agp1 wird damit erklärt, dass sich das konjugierte Pi-System über den Ring A erstreckt und die Strukturänderung dieses Ringes, den durch die Z/E Isomerisierung hervorgerufenen Vorzeichenwechsel kompensiert.

Phytochromes are photoreceptors in which red- or far-red-light induces the conversion between the red-light absorbing form Pr and far-red absorbing form Pfr. The photoconversion is initiated by the Z/E isomerization of the 15, 16-double bound of the bilin chromophore that is followed by a sequence of relaxation processes involving structural rearrangements of the protein. In this work, the kinetics of the photoconversion after excitation of the Pr state of the Biliverdin-adducts Agp1 from Agrobacterium tumefaciens and Ppr from Rhodospirillum centenum were studied by flash spectroscopy. Ppr is a hybrid of two photoreceptor proteins, PYP and phytochrome. Ppr is not able to form the Pfr state, although the sequence of Ppr includes all known essential amino acids for the Pfr formation. Another focus was the dependency of the phytochrome photoconversion on the kinetics of the PYP-domain. As in plant phytochrome the photoconversion of Agp1 involves three intermediates denoted as Lumi-R, Meta-Ra and Meta-Rc. The analysis of different fragments of Agp1 showed that the histidine kinase domain does not affect the photoconversion and the PHY domain is essential for the Pfr formation. Deletion of the amino acids 2-19 of Agp1 (Δ18N) prevents the covalent binding of the chromophore but leads to only minor changes in the photoconversion. H/D isotope exchange and analysis of the pH-dependence of the kinetics indicate that several proton- transfer processes are involved in the photoconversion. Measurements with a pH-indicator dye revealed transient proton release and partial proton uptake during photoconversion. The conserved amino acids D197 and H250 could play a crucial role in these proton transfer steps, because their substitution leads to a lowering of the pK of the protonated chromophore and to the inhibition of Pfr formation. Utilization of the locked 5Zs chromophore was used to demonstrate that a structural change of the A-B methine bridge is involved in the Pr to Pfr photoconversion which occurs in the Meta-Ra to Meta-Rc transition. Experiments with the 18EtBV adduct of Agp1 showed that the reduced flexibility of the C18 vinyl group in biliverdin decelerates the formation of Pfr. CD-spectroscopy showed that the chirality of the chromophore in the Pr state of Agp1 is the same as in other phytochromes. Upon photoconversion, most phytochromes show a sign reversal in the ellipticity of the main bands. The absence of this sign reversal in the CD spectra of the BV-adduct of Agp1 can be explained by the extension of the pi conjugated system over ring A. The structural change of this ring compensates the sign reversal due to the Z/E isomerization of the C-D methine bridge.