The type II anti-CD20 monoclonal antibody Obinutuzumab (O) combined with cyclophosphamide, adriamycin, vincristine, and prednisone, also known as O-CHOP, didn’t show superiority over type I antibody Rituximab (R) combined with CHOP (R-CHOP) in the Phase III GOYA clinical trial1 which included 1,418 diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) patients. However, further analysis of the cohort by the cell of origin identified 25% of the overall population as a strong germinal center B-cell (GCB) subgroup, characterized with a higher t(14,18)(q32;q21) translocation incidence rate, in which O-CHOP demonstrated superiority to R-CHOP. Our previous work reported that primary GCB-like Eμ-myc mouse lymphoma samples transduced with Bcl2 are prone to senescence. It has been long known that chemotherapy may result in cellular senescence, and more recent work has indicated senescence to potentially have a detrimental effect, to some extent, due to senescence-associated secretory phenotype (SASP) and senescence associated stemness (SAS). However, it is not known whether senescence underlies the differential O-CHOP vs. R-CHOP treatment efficacy in strong GCB patients. As a possible mechanism, I explored the Ab-mediated direct killing of senescent human DLBCL cells. Methods DLBCL cell lines with or without t(14,18) (t+ or t-) were treated with Obinutuzumab or Rituximab in different concentrations. The viable cell number was measured by flow cytometry. These cell lines were first treated with ADR and induced to enter cellular senescence. Senescence-associated beta-galactosidase (SA-β-gal) activity, SASP, and SAS gene expression were evaluated for confirmation of the senescent status. Next, the senolytic capability of Obinutzumab and Rituximab was tested for Ab-mediated direct killing of the senescent cells. The senolytic result was verified by detecting senescence markers, e.g., detecting H3K9me3, p16, and γH2AX by western blot. Further mechanisms of how the senescent cells were killed were monitored by lyso-sensor tracking lysosomal pH changes as a part of the senolytic process. Cleaved Caspase-3 was used as an indicator of apoptosis during the senolytic process. Results In Ab-mediated direct killing assay, Obinutuzumab showed stronger efficacy than Rituximab in both t+ and t- cell lines. Obinutuzumab also exerted higher cytotoxcity in the t+ subgroup as compared to the t- subgroup. ADR-induced senescence in DLBCL cell lines induced higher SA-β-gal activity and SASP as well as SAS gene expression. In particular, Obinutuzumab had higher senolytic capability in the t+ cell lines. The senolytic process of Obinutuzumab in the t+ was associated with lysosome status. Conclusions Obinutuzumab had higher Ab-mediated direct killing and senolytic capability than Rituximab in vitro. These findings might explain, at least in part, why the subgroup of strong GCB patients presented with longer progression-free survival after O-CHOP treatment in the GOYA clinical trial.
In der Phase III-Studie „GOYA“, an der 1.418 Patientinnen und Patienten mit diffus großzelligem B-Zell-Lymphom (DLBCL) teilnahmen, zeigte der monoklonale Typ-II-Anti-CD20-Antikörper Obinutuzumab (O) in Kombination mit Cyclophosphamid, Adriamycin, Vincristin und Prednison (O-CHOP) keine Überlegenheit gegenüber dem Typ-I-Antikörper Rituxmab (R) in Kombination mit CHOP (R-CHOP). Eine weitere Analyse der Kohorte hinsichtlich der Ursprungszelle identifizierte jedoch 25% der Gesamtpopulation als eine starke Keimzentrums-B-Zell (GCB)-Subgruppe, die durch eine höhere t(14,18)(q32;q21)-Translokationsrate charakterisiert war und bei der O-CHOP eine Überlegenheit gegenüber R-CHOP zeigte. Vorherige Arbeiten unserer Gruppe zeigten, dass GCB-ähnliche primäre Eμ-myc-Maus-Lymphome, die mit Bcl2 transduziert wurden, anfällig für Seneszenz sind. Es ist bereits bekannt, dass eine Chemotherapie zu zellulärer Seneszenz führen kann, wobei jüngere Arbeiten zeigen, dass Seneszenz aufgrund des Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyps (SASP) und der Seneszenz-assoziierten Stammzell-Reprogrammierung (SAS) auch eine schädliche Wirkung entfalten kann. Inwiefern Seneszenz an der unterschiedlichen Wirksamkeit von O-CHOP- vs. R-CHOP in der starken GCB-Subgruppe beteiligt sein könnte, ist bisher nicht bekannt. In dieser Arbeit habe ich den möglichen Mechanismus der Antikörper (Ab)-vermittelten direkten abtötenden Wirkung auf seneszente humane DLBCL-Zelllinien in vitro untersucht. Methoden DLBCL-Zelllinien mit oder ohne t(14,18)-Translokation (t+ oder t-) wurden in verschiedenen Konzentrationen mit O oder R behandelt. Die Anzahl viabler Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen. Zunächst erfolgte die Behandlung der Zelllinien mit Adriamycin, um zelluläre Seneszenz zu induzieren. Die Aktivität der Seneszenz-assoziierten beta-Galaktosidase (SA-β-gal) sowie die Expression von SASP- und SAS-Genen wurden zur Bestätigung der Seneszenzauslösung evaluiert. Als nächstes wurde die senolytische Fähigkeit von O und R auf die Ab-vermittelte direkte Abtötung der seneszenten Zellen getestet. Das senolytische Ergebnis wurde durch den Nachweis von Seneszenz-Markern wie H3K9me3, p16 und γH2AX durch Western Blot verifiziert. Weitere Mechanismen der Abtötung seneszenter Zellen wurde mittels Überwachung lysosomaler pH-Veränderungen als Teil des senolytischen Prozesses untersucht. Geteilte Caspase-3 wurde als Apoptoseindikator während des senolytischen Prozesses verwendet. Ergebnisse Hinsichtlich der Ab-vermittelten direkten Zytotoxizität in den t+ - und t- -Zelllinien zeigte O in beiden Untergruppen eine stärkere Wirksamkeit als R, wobei O in der t+ -Untergruppe stärker zytotoxisch als in der t+ -Untergruppe wirkte. Adriamycin-induzierte Seneszenz zeichnete sich in DLBCL-Zelllinien durch eine hohe SA-β-Gal-Aktivität und eine erhöhte SASP- und SAS-Genexpression aus. Im Speziellen zeigte O eine höhere senolytische Fähigkeit in den t+ -Zelllinien. Der senolytische Prozess von O war in den t+-Zelllinien mit dem Lysosomenstatus assoziiert. Schlussfolgerung O hat eine höhere Wirksamkeit hinsichtlich der Ab-vermittelte direkten Abtötung und eine höhere senolytische Fähigkeit als R. Dies könnte einer der Gründe dafür sein, dass Patientinnen und Patienten mit starker GCB-Subgruppe in der GOYA-Studie durch die O-CHOP-Behandlung ein längeres progressfreies Überleben erzielten.
