Adoptive Immunzelltherapien haben sich als vielversprechend und innovativ in der Krebsforschung behaupten können. Eine Form verwendet T-Zellen, die chimäre Antigenrezeptoren (CAR) exprimieren. Trotz bemerkenswerter Fortschritte im Bereich der CAR-T-Zelltherapie ist eine erhebliche Diskrepanz zwischen hämatologischen und soliden Tumorerkrankungen im Hinblick auf erste klinische Erfolge festzustellen. Während das klinische Ansprechen auf eine CAR-T-Zelltherapie bei der Mehrzahl hämatologischer Patienten exzellent ist, ist eine ähnlich erfolgreiche Anwendung bei soliden Tumoren bislang nicht gelungen. Man geht davon aus, dass das immunsuppressive Mikromilieu solider Tumoren eine Barriere für den Eintritt und die Effektivität zellbasierter Therapien darstellt. Die Kombination von CAR-T-Zelltherapie und PD-1-Checkpoint-Inhibitoren kann sich den Mechanismen der Immunevasion der Tumore entgegensetzen und die Anti-Tumor-Aktivität erhöhen. In dieser Arbeit evaluierten wir den Einfluss der PD-1/PD-L1-Achse und die Wirkung eines PD-1-Inhibitors in in vitro Ko- Kulturen von Neuroblastom-spezifischen CAR-T-Zellen mit verschiedenen Neuroblastomzelllinien. Der verwendete CAR erkennt das Tumor-assoziierte Antigen L1CAM, ein von Neuroblastomzellen exprimiertes neurales Zelladhäsionsmolekül. Durchflusszytometrie-basierte Analysen und Luciferase-basierte Reportergen-Assays wurden verwendet, um die PD-1/PD-L1-Expression auf CAR-T- und Tumorzellen sowie die zytotoxische Aktivität der CAR-T-Zellen zu beurteilen. Es wurden zwei Neuroblastomzelllinienmodelle generiert, die SK-N-BE(2)PD-L1+, die lentiviral mit PD-L1 transduziert wurden, und die SK-N-BE(2)PD-L1-KO, deren PD-L1 Genlocus mittels CRISPR/Cas 9 irreparabel zerstört wurde, um den Einfluss des PD-L1-Expressionsniveaus auf die PD-1/PD-L1 vermittelte Inhibition zu bewerten. Die Ko- Kultivierung von Neuroblastomzelllinien und CAR-T-Zellen führte zur Hochregulation der PD-L1-Expression auf Neuroblastomzellen, was die adaptive Immunresistenz dieser bestätigte, und zur Induktion der PD-1/PD-L1-Expression in den CAR-T-Zellen. Der PD- 1-Inhibitor, Nivolumab, verstärkte die zytotoxische Aktivität der CAR-T-Zellen. Der Einfluss der PD-1-Blockade spiegelte sich nicht in einer veränderten Zytokinfreisetzung oder verminderten Apoptoserate der CAR-T-Zellen wider und das Ausmaß des Nutzens der PD-1-Blockade korrelierte nicht mit der PD-L1-Expression auf Neuroblastomzellen. Tatsächlich war der Erfolg der PD-1-Blockade von einer starken PD-1/PD-L1-Expression der CAR-T-Zellen selbst abhängig, die wiederum von der kostimulatorischen Domäne des CAR-Konstrukts und vor allem von der ausgewählten T-Zell-Fraktion für die CAR-T- Zellgenerierung abhing. Daher könnte die Auswahl der T-Zell-Fraktion und ein anschließendes Screening des PD-1/PD-L1-Expressionspiegels generierter CAR-T- Zellen dazu beitragen, festzustellen, wann eine Kombinationstherapie mit PD-1- Checkpoint-Inhibitoren die Effektivität der CAR-T-Zelltherapie verbessern könnte.
Despite the remarkable potency of CD19-targeting CAR T cells against hematological malignancies, similar results have not yet been achieved for CAR T cell therapy of solid tumors. The immunosuppressive microenvironment in solid tumors is thought to contribute to the observed impediment of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy efficacy. A combinational treatment approach for CAR T cell therapy with complementing immunotherapies such as Programmed Cell Death-1 (PD-1) checkpoint inhibitors has proven to oppose immune escape mechanisms of solid tumors and augment anti-tumor efficacy. In this study, we evaluated the PD-1/PD-L1 checkpoint axis and the impact of a PD-1 inhibitor on CAR T cell efficacy in different in vitro co-culture set-up of neuroblastoma-specific CAR T cells with neuroblastoma cell lines. The CAR used recognizes the tumor-associated antigen L1CAM, a neural adhesion molecule expressed by neuroblastoma cells. Two neuroblastoma cell models were generated, the SK-N- BE(2)PD-L1+, which stably expresses PD-L1 from a lentiviral vector, and the SK-N-BE(2)PD- L1-KO using CRISPR/ Cas 9 to knock out PD-L1 to assess the impact of PD-L1 expression levels on the PD-1/PD-L1 signaling capacity. Flow cytometry-based analyses and luciferase reporter assays were used to assess PD-1/PD-L1 expression on CAR T and tumor cells as well as CAR T cell directed-killing of neuroblastoma cells. Co-culturing neuroblastoma cell lines with L1CAM-CAR T cells upregulated PD-L1 expression on neuroblastoma cells, confirming adaptive immune resistance. In L1CAM-CAR T cells the expression of the PD-1/PD-L1 axis was induced after co-culture. The PD-1 checkpoint inhibitor, nivolumab, enhanced L1CAM-CAR T cell-directed killing. However, this benefit was not reflected in altered L1CAM-CAR-T cell cytokine release or decreased apoptosis. Interestingly, nivolumab-enhanced L1CAM-CAR T cell killing did not strictly correlate with PD-L1 expression on neuroblastoma cells. In fact, checkpoint inhibitor success relied on strong PD-1/PD-L1 axis expression in the L1CAM-CAR T cells themselves not tumor cells, which in turn depended on co-stimulatory domains within the CAR construct, and more importantly, on the subset of T cells selected for L1CAM-CAR T cell generation. Thus, T cell subset selection for CAR T cell generation and screening generated CAR T cell for PD-1/PD-L1 expression could help determine when to combine CAR T cell therapy with checkpoint inhibitors to improve treatment efficacy.
