Gag, der Polyproteinvorläufer der HIV-1-Strukturproteine, assembliert an der Plasmamembran der Wirtszelle neue Virionen, die mithilfe zellulärer ESCRT-Proteine freigesetzt werden. Zwei ESCRT-Proteine, TSG101 und ALIX, binden an das carboxyterminale p6-Peptid von Gag. Die Bindung von TSG101 ist für eine effiziente Virusfreisetzung wichtig. Der Mechanismus, über den ESCRT-Proteine die Virusfreisetzung unterstützen, ist aber wenig verstanden. Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae hat als zellbiologischer Modellorganismus wesentlich zur Charakterisierung der zellulären ESCRT-Funktion beigetragen. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, ob ein Hefemodell zur Analyse von Mechanismen der Virusfreisetzung nützlich sein kann. Die Freisetzung von Gag in Form virusähnlicher Partikel aus Hefesphäroplasten war beschrieben. Die Gagfreisetzung nach dem publizierten Protokoll war aber ESCRT-unabhängig. Im Hefemodell dieser Arbeit war die Gag-GFP-Freisetzung aus Sphäroplasten von ESCRT-Deletionsmutanten stark reduziert. Mit Koimmunpräzipitations- und GST-Pull-down-Experimenten wurde die Bindung von Gag an zwei ESCRT-Proteine der Hefe, Vps23 und Bro1, den Homologen zu TSG101 und ALIX, untersucht. Dabei wurde eine bis dahin unbekannte Interaktion zwischen ESCRT-Proteinen und der aminoterminalen Proteinregion von Gag entdeckt. Davon ausgehend wurden Mutationen in der plasmamembranbindenden Matrix-Domäne von Gag gesucht, die diese Interaktion reduzieren. Mit Fluoreszenzmikroskopie und der Präparation membranhaltiger Zentrifugationssedimente wurde die Plasmamembranassoziation von Gag-GFP mit entsprechenden Mutationen analysiert. Die Mutation der Matrix-Domäne verstärkte die Membranbindung und ESCRT-abhängig die Freisetzung von Gag-GFP. In Übereinstimmung damit steigerte die Mutation die Gag-GFP-Freisetzung aus humanen HEK293-Zellen. In GST-Pull-down-Experimenten präzipitierten auch ALIX und TSG101 mit Matrix. Die Bindung an Matrix im Verhältnis zum p6-Peptid war für ALIX stärker als für TSG101. Passend zu diesem Ergebnis war die gesteigerte Gag-GFP-Freisetzung aus HEK293-Zellen bei Mutation der Matrix-Domäne teilweise von der ALIX-Bindungsstelle in p6 abhängig, obwohl die Mutation der ALIX-Bindungsstelle keinen Einfluss auf die Freisetzung von Gag-GFP zeigte. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind durch ein Modell erklärbar, in dem eine transiente Matrix-ESCRT-Interaktion bei Bindung von Gag an die Plasmamembran gelöst wird. Dieser Schritt könnte die in der Interaktion mit Matrix inaktiven ESCRT-Proteine in einen aktiven Zustand überführen und dazu beitragen, die ESCRT-Funktion mit der Gagassemblierung zu koordinieren.
The HIV-1 structural polyprotein Gag assembles at the host cell plasma membrane and drives virion budding, assisted by the cellular ESCRT proteins. Two ESCRT proteins, TSG101 and ALIX, bind to the Gag C-terminal p6 peptide. TSG101 binding is important for efficient HIV-1 release, but how ESCRTs contribute to the budding process is poorly understood. The baker's yeast Saccharomyces cerevisiae, a model organism in cell biology, has been used to characterize the cellular ESCRT function. This work analyzes whether a yeast model can be useful to study the mechanisms of HIV-1 release. Previous work reported Gag budding from yeast spheroplasts, but Gag release was ESCRT independent. In this work, spheroplasts of yeast ESCRT knockout mutants strongly diminished Gag-GFP release. I used GST-pulldown and coimmunoprecipitation experiments to characterize the interaction of Gag with Vps23 and Bro1, the yeast homologs of TSG101 and ALIX. I identified a previously unknown interaction between ESCRT proteins and the Gag N-terminal protein region. Subsequently, I searched for mutants in the Gag-plasma membrane-binding matrix domain that reduced this interaction. By using fluorescence microscopy and preparing membrane-containing centrifugation sediments, I analyzed the plasma membrane binding of corresponding Gag-GFP mutants. Matrix mutation increased Gag-GFP release in an ESCRT-dependent manner and Gag-GFP-plasma membrane binding. Similarly, matrix mutation enhanced Gag-GFP release from human HEK293 cells. In GST-pulldown experiments, ALIX and TSG101 also precipitated with matrix. The relative affinity for matrix compared with p6 was higher for ALIX than for TSG101. Accordingly, enhancement of Gag-GFP release by matrix mutation partly depended on ALIX binding to p6, although ALIX-binding site mutation did not impair release of Gag-GFP. The results fit with a model in which a transient matrix-ESCRT interaction is replaced when Gag binds to the plasma membrane. This step may activate ESCRT proteins the activity of which was blocked by binding to matrix. Thereby, this mechanism may coordinate ESCRT function with virion assembly.
