Studies on moderately halophilic bacteria have been increased in the last decade. These studies are mainly focused on their ecology, physiology, taxonomy or phylogenetic relationships. However, it is very important to understand the survival and growth of these microorganisms under long-term stress environments, especially elevated temperatures and hypersaline conditions. Understanding the unique stress tolerance mechanisms of moderately halophilic bacteria will provide novel approaches to science and biotechnology. Unfortunately, very few genomic studies are available about these microorganisms and it is not easy to understand adaptation mechanisms of moderately halophilic bacteria since only limited genetic information is provided. Since proteomics is an important method of gaining data about protein expression levels of these microorganisms, proteome studies of moderately halophilic bacteria possess potent challenge to gain the essential physiological data. This work was initiated by the new isolation of 11 unknown bacterial strains from Çamaltı Saltern Area near Izmir. The goal of this thesis is to test possible isolation protocols and different proteomic approaches for studying these strains, and to gain information about the type of these new isolates in comparison with related bacteria. On the basis of preliminary biochemical studies, the moderately halophilic bacteria H. salina DSMZ 5928 as model organism and one of the new isolates, Isolate No 6, were selected to study large–scale proteomics and to identify variations in expressions and to find homologous proteins without full genome knowledge. In this study, high resolution 2-DE gel separation in combination with high throughput MS analysis and N-terminal Edman sequencing have been applied to identify the interesting proteins and proved to be effective for proteome analysis of these moderate halophiles. Different techniques for peptide fragmentation, such as electrospray tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometry (ESI-QqTOF MS/MS), MALDI-quadrupole time-of-flight mass spectrometer (MALDI-QqTOF MS) as well as tandem time-of-flight mass spectrometer (MALDI TOF/TOF MS) were applied. ESI-QqTOF MS/MS of the peptide mixture of selected protein spots gave acceptable results to identify and to find homologous proteins for these microorganisms. Also, N-terminal analysis combined with BLAST searches gave good matches from the protein databases. As can be expected, the proteins or their homologous correspondence, which were not present in the public databases, did not lead to their identification even though good spectra were achieved. Annotations of the identified proteins were facilitated by highly automated bioinformatics tools, such as ExPASy Proteomics server, NCBI website, KEGG database (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) with e.g. BRITE, BIOCyc and METACyc tools. These sites provided many links to different branches of information and special annotations for individual data. In addition to own extensive literature searches bioinformatic tools helped us to check experimental data by comparison to theoretical data and also to results of other fields, like toxicology, physiology, pharmacology, and industrial applications. As shown in this thesis, in the current situation, bacterial proteomes of new organisms without any detailed knowledge of genome data can be studied effectively, enlarging data sets in various ways. Although genomic knowledge would build the basic information, differences in protein expression studies under various cultural conditions can be addressed. In these exceptional cases, direct proteomics work can answer many questions in combination with the help of bioinformatics. Totally 15 proteins of Halomonas salina have been identified using mass spectrometric techniques. 2 of these identified proteins, which are aconitate hydratase and hypothetical protein ECA3428 have been studied both from group 1 and group 2 gels. 7 of these identified proteins are important enzymes, which generally take role in energy metabolism, TCA cycle, as well as nucleotide and amino acid metabolism. 2 of the identified proteins take role in transportation. Another 2 are hypothetical proteins. The other individual proteins function in translation, DNA replication, respiration and metabolism of cofactors and vitamins. The codes of the studied protein spots, their identification methods, identified homologous proteins and their probable functions are summarized in tables 5.3 and 6.3. In the case of Isolate No 6, totally 16 proteins have been identified using both mass spectrometric techniques and N-terminal Edman sequencing method. 11 of the identified proteins are important enzymes that take role in energy metabolism, TCA cycle, amino acid, fatty acid metabolisms, glycolysis, ectoine and osmoprotectant synthesis and cell signalling. Other individual identified proteins take role in solute diffusion, structure rigidity, transportation, defensive against stress and protein biosynthesis. The codes of the studied protein spots, their identification methods, identified homologous proteins and their probable functions are summarized in tables 5.4 and 6.2.
In den letzten Jahren wurden zahlreiche Studien an moderaten, halophilen Bakterien iniziiert. Diese Arbeiten haben sich meist auf ökologische, physiologische und taxonomische Studien und ihre phylogenetische Relationen beschränkt. Für die Klärung der Fragen zum Überleben und zum Wachstum solcher Mikroorganismen unter hohen Stressbedingungen, besonders bei erhöhten Temperaturen und unter hypersalinen Konditionen, sind solche Untersuchungen essentiell. Ein Verständnis der einzigartigen Toleranzmechanismen der moderaten Halophilen würde neue Ansätze für wissenschaftliche Studien und zur Anwendung auf die Biotechnologie eröffnen. Mit Hilfe von Proteomics-Studien können wertvolle neue Informationen über die Proteinexpression unter unterschiedlichen physiologischen Bedingungen erhalten werden, selbst wenn das Genom dieser Stämme noch nicht oder nicht vollständig zur Verfügung steht. Daher sind Proteom-analytische Untersuchungen an moderat halophilen Bakterien sinnvoll, um wichtige physiologische Daten zu erhalten. Diese Arbeit wurde initiiert durch Isolierung von 11 unbekannten, bakteriellen Proben von der Calmati Salz-Area nahe Izmir. Das Ziel dieser Arbeit war es, geeignete Protokolle für die Isolierung und für direkte Proteomics-Studien zu erarbeiten, um über Typ und Physiologie dieser Bakterienstämme Auskünfte zu gewinnen, auch im Vergleich zu möglichen bekannten Bakterien. Auf der Basis von vorläufigen biochemischen Studien wurde das moderate, halophile Bakterium DSMZ 5928 als Modellorganismus im Vergleich zu einem der Proben, dem Isolat Nr.6 für diese Proteomics-Studien ausgewählt. Es sollten Unterschiede in den Expressionsraten der Proteine und homologe Proteine identifiziert werden. Dazu wurden die Gesamtproteingemische durch hochauflösende 2DE-Gelelektrophorese getrennt und interessante Proteine mittels verschiedener massenspektrometrischen Techniken und durch N-terminale Edman-Sequenzierung analysiert. Dieser Proteom-analytische Ansatz erwies sich als effektiv für vergleichende Studien dieser moderaten halophilen Bakterien. Für die massenspektrometrische Identifizierung der selektierten Proteine wurden deren tryptische Peptidgemische verschiedenen MS-Techniken unterworfen, wie Elektrospray- Tandem-Quadrupole-TOF-MS/MS (ESI-QqTOF(time-of-flight)-MS/MS), MALDI-Quadrupole-TOF-MS (MALDI-QqTOF MS) und Tandem-TOF-MS (MALDI TOF/TOF MS). ESI-QqTOF MS/MS der tryptischen Peptide von ausgewählten Protein-Spots gaben zufriedenstellende Ergebnisse, um diese Proteine eindeutig zu identifizieren oder homologen Proteinen aus Datenbanken zuzuordnen. Zusätzlich wurden N-terminale Sequenzanalysen durchgeführt, kombiniert mit “BLAST” Vergleichen, die zum Teil sehr gute Ergebnisse lieferten. Wie natürlich erwartet werden konnte, ergaben Proteine, die noch nicht in den vorhandenen Datenbanken vorkommen oder von denen keine Homologe mit den Suchmaschinen gefunden werden konnten, keine Identifizierungsmöglichkeiten, selbst wenn ausgezeichnete MS- Spektren erhalten wurden. Die Annotation der identifizierten Proteine wurde durch Bioinformatics-Suchmaschinen in den Datenbanken erleichtert, wie z.B. dem ExPASy Proteomics Server, der NCBI website, der KEGG Datenbank (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) mit Suchmaschinen für Taxonomie, Zellzyklen, Stoffwechseldiagrammen, wie mit BRITE, BIOCyc und METACyc, und durch viele Links zu verschiedenen Themen der biochemischen Forschung. Zusätzlich zu intensiven Literaturrecherchen erlaubte die Anwendung der Bioinformatics Suchmaschinen den Vergleich der experimentell gefundenen Ergebnisse mit theoretischen Daten und hat die Anbindung an andere Fachgebiete wie Toxikologie, Phylogenie, Physiologie, Pharmakologie und zu industriellen Anwendungen ermöglicht. Wie die vorliegende Studie zeigte, helfen Proteomics- Studien bei neu isolierten Organismen auf verschiedene Weise effektive Ergebnisse zu erzielen, selbst wenn ihre Genomdaten noch nicht bekannt oder unvollständig sind. Obwohl die Genomanalyse als Basisinformation im Prinzip unverzichtbar ist, können Unterschiede bei den neu isolierten Mikroorganismen durch vergleichende Expressionsstudien unter verschiedenen Kulturbedingungen mittels hochauflösender 2DE-Gelelektrophorese in Kombination mit Massenspektrometrie, bzw. durch N-terminale Sequenzierung sinnvoll untersucht werden. Wie gezeigt wurde, kann die direkte Proteom-Analyse durchaus viele Fragen in Verbindung mit den nötigen Bioinformatik-Maschinen angehen. Insgesamt wurden 15 Proteine von Halomonas salina mit massenspektrometrischen Mitteln identifiziert, 2 von ihnen sind Aconitathydrase und hypothetisches Protein ECA3428, aus zwei der studierten Gele. 7 der identifizierten Proteine sind wichtige Enzyme, z.B. involviert in Energiemetabolismus, TCA ZyKlus, Nukleotid- und Aminosäure-Stoffwechsel; 2 Proteine sind am Transport beteiligt, 2 sind hypothetische Proteine; die anderen sind bei der Translation, bei DNA Replikation, Respiration und beim Metabolismus der Co- Faktoren, bzw. Vitamin-Stoffwechsel beteiligt. Die Proteine, ihr Code, ihre Identifikationsmethode und ihre wahrscheinliche Funktion sind in der Tabelle 5.3 and 6.3 verzeichnet. Vom Isolat Nr.6 konnten 16 Proteine mittels Massenspektrometrie und Edman-Sequenzierung identifiziert werden. 11 der identifizierten Proteine sind ebenfalls wichtige Enzyme, involviert in Energie-Stoffwechsel, TCA-Zyklus, Aminosäure- und Fettsäure-Metabolismus, Glykolyse, Ectoin- und Osmoprotektant-Synthese und Zellsignaling. Andere identifizierte Proteine spielen eine Rolle bei Diffusion, Strukturfestigkeit, Transport, Proteinbiosynthese oder sind Defensive gegen Stress. Diese Proteine, ihr Code, ihre Identifizierung, identifizierte Homologe und ihre wahrscheinliche Funktion sind in Tabelle 5.4 und 6.2 zusammengefasst.
