In dieser Arbeit wurde die transmembranäre allosterischen Bindungsregion des humanen Thyrotropinrezeptors (TSHR) funktional untersucht. Der TSHR gehört als Rhodopsin-ähnlicher G-Protein gekoppelter Rezeptor zur Untergruppe der Glykoproteinhormonrezeptoren. Er weist eine Liganden unabhängige permanente G-Protein Stimulation auf. Die Bindung von Autoantikörpern, an die orthosterische Bindungsstelle des Hormons TSH, oder das Vorkommen inaktivierender oder aktivierender Mutationen löst pathogene Mechanismen aus, die zu Hypo- oder Hyperthyreose führen. Die derzeitige Therapie greift nicht direkt am TSHR an. Die Entwicklung eines kausalen Therapieansatzes, mittels allosterisch bindender Liganden am TSHR, ist eine Möglichkeit, diese Lücken zu schließen. Deshalb wurden in dieser Arbeit die funktionalen Eigenschaften von 21 TSHR-Mutanten im Bereich der allosterischen Bindungsregion im Detail charakterisiert, so daß nun Angaben für alle auskleidenden Aminosäurereste der Bindungsregion verfügbar sind. Es wurden sechs konstitutiv aktivierende Mutationen und zehn konstitutiv inaktivierende Mutationen innerhalb der allosterischen Bindungsregion des TSH-Rezeptors gefunden. Aminosäurenaustausche, welche die Aktivität des Rezeptors verändern, geben dabei Hinweise auf bestehende Struktur-Funktions-Beziehungen, die den Signalisierungsmechanismus des Rezeptors beeinflussen. Konstitutiv aktivierende Mutationen verändern die Rezeptorstruktur zu einer aktiveren Konformation hin. Insbesondere die konstitutiv aktivierenden Mutationen an Position 637 (6.48) der Transmembranhelix 6 weisen auf eine eine zentrale Rolle im Zusammenwirken der Transmembranhelizes während des Aktivierungsprozesses hin. Konstitutiv inaktivierende Mutationen verschieben das Gleichgewicht in Richtung einer inaktiveren Konformation. Diese Mutationen sind, entsprechend des Homologiemodells der Transmembrandomäne des TSH- Rezeptors, als Anhäufung in den Bereichen zwischen den Transmembranhelizes 3, 4, 5 und der extrazellulären Schleife 2 (Cluster I) sowie den Transmembranhelizes 1, 2 und 7 (Cluster II) zu finden. Es konnte gezeigt werden, dass sich im Bereich der allosterischen Bindungsregion eine hohe Dichte an signalisierungssensitiven Aminosäureresten befindet. Das mit diesen Untersuchungen gewonnene tiefere Verständnis über die molekularen Mechanismen in diesem Bereich, ist Grundlage für die Erklärung und für die Vorhersage der Wirkungsweise kleiner Molekülliganden. So war es in dieser Arbeit möglich den antagonistischen Effekt des allosterischen Liganden c52, durch eine gezielte Mutation der Bindungsregion des TSH-Rezeptors, in einen agonistischen Effekt umzuwandeln. Die Lage und Orientierung dieses Liganden bestätigt die vorhergesagten Wechselwirkungsmodelle und zeigt, dass die korrespondierenden wildtypischen Aminosäuren konstitutiv aktivierender Mutationen und konstitutiv inaktivierender Mutationen potentielle Interaktionspunkte für allosterische Agonisten bzw. Antagonisten sind.
This study focuses on the functional characterization of the transmembranal allosteric binding region of the human thyroid stimulating hormone receptor (TSHR). The TSHR is a rhodopsin-like G-protein coupled receptor and belongs to the subclass of the glycoprotein hormone receptors. It exhibits an elevated level of cAMP accumulation in the basal state. Antibodies directed against TSHR and naturally occurring mutations in TSHR are determinants of several thyroid malfunctions, which are characterized by a hyper- or hypofunctioning thyroid gland. A potential approach for treatment of these diseases could be the direct manipulation of the TSHR activation by low molecular weight (LMW) drug like molecules. LMW synthetic ligands bind allosterically into a binding pocket within the transmembrane domain. Therefore we want to understand the intramolecular events that occur in the proximity of the allosteric binding pocket, in order to support the development of new LMW ligands. Guided by homology modelling 21 amino acid residues surrounding the allosteric binding region were selected for site-directed mutagenesis. As a result there are now functional data available for all amino acids covering the binding pocket. We observed two interesting types of signalling-sensitive TSHR mutations, ten constitutively inactivating mutations and six constitutively activating mutations. These side-chain alterations, modifying the activity state of the receptor, provide evidence for structure-function-relationships concerning the signalling mechanism. Constitutively activating mutations induce a shift towards the active receptor conformation and mark potential trigger points for receptor activation by LMW agonists. Especially the constitutively activating mutations at position 637 (6.48) at transmembrane helix (TMH) 6 seem to indicate a key role of this residue during the activation process. Constitutive inactivating mutations alter the receptor conformation towards a more inactive state. Therefore they are preferred contact points where potential inactivating molecules can block receptor activation. We could show, that there is a high density of signalling-sensitive amino acids surrounding the allosteric binding region of the TSHR. This gained knowledge about the molecular mechanisms in this area is the basis for the explanation and prediction of the effectiveness of small molecules. In this study we showed the functional switch of the allosteric antagonist c52 to an agonistic acting molecule by site-directed mutagenesis of the binding region. The position and orientation of this molecule supports the predicted interplay between the ligand and the amino acid side chains. It provides evidence for the notion, that the corresponding wild-type amino acid residues of constitutive activating or inactivating mutations are potential interaction points for allosteric agonists or antagonists.
