Identification and Functional Characterization of Novel Plasma Cell-Specific Surface Antigens in Multiple Myeloma

Abstract

Multiple myeloma (MM) is a clonal B-cell tumour of differentiated and usually slowly proliferating plasma cells, mainly located in the bone marrow. MM is still an incurable disease with a median survival of about 3 to 5 years, and it is responsible for about one percent of all cancer-related deaths in Western countries. However, the precise molecular events causing multiple myeloma are still not fully understood. Immunotherapeutic approaches are playing an increasing role in the development of novel treatment strategies of various malignancies. In particular, the use of recombinant bispecific single- chain antibodies (bssc-ABs) is gaining in importance, because these molecules possess exceptional biological properties. However, to date the lack of suitable plasma cell-specific surface antigens has hindered the development of antibody-based treatment strategies for MM. In order to identify such plasma cell-specific antigens hybridoma supernatants (generated by Dr. Axel Greiner, University of Würzburg) were screened by flow cytometry with a panel of human multiple myeloma, plasma cell leukaemia, and B-cell lymphoma cell lines. Three supernatants were found reactive with human MM cell line RPMI-8226. Western blot analysis revealed a band of ~25kDa. A single specific spot was identified with two-dimensional SDS-PAGE and Western blotting of RPMI-8226 membrane proteins and this protein-spot was further analysed by MALDI/MS. Database comparison of the peptide sequence identified the putative plasma cell- specific antigen as human lambda light chain. Recently a novel monoclonal antibody (mAB), designated anti-Wue-1, has been generated which specifically binds to the cell surface of normal and malignant human plasma cells (PC) and mucosa-associated lymphoid tissue (MALT) lymphoma with PC differentiation. On basis of the anti-Wue-1 mAB, a novel MM directed recombinant bispecific single-chain antibody was engineered, designated bssc-anti-Wue-1xCD3 or MT105. Part of this project was to analyze the biological properties of bssc-anti- Wue-1xCD3, using the MM cell line NCI-H929 co-cultured with effector T-cells, isolated from buffy coats of healthy donors. It was demonstrated that bssc- anti-Wue-1xCD3 induces efficient T-cell mediated cell death of NCIH929 cells. In contrast to conventional bispecific antibodies, bssc-anti-Wue-1xCD3 was efficacious at low effector to target (E:T) ratios and without any additional T-cell stimulation. The third part of this PhD project was dedicated to the identification, cloning and functional characterization of the novel WUE-1 antigen. First, WUE-1 positive MM cell lines were identified, using flow cytometry. However, further characterization of the antigen by standard methods such as Western blot analysis or immunoprecipitation kept failing. Subsequently, the attempt was undertaken to isolate the antigen by means of expression cloning and immunoselection with anti-Wue-1 mAB ("panning"). The isolated clones were analyzed by sequencing, Northern blotting, and flow cytometry, but the clones turned out to contain only non-specific inserts. Since the efficacy of the single-chain (sc) anti-Wue-1 antibody and its advantages over the parental mAB were successfully shown, a recombinant chimeric T-cell receptor (TCR) was generated, comprising the variable single chain (Fv sc) anti-Wue-1 antibody domain, attached to a human IgG Fc sequence, the transmembrane CD28 moiety, and an intracellular CD3-_eta signalling domain. This WUE-1 specific TCR was used to develop a novel assay for use in a multiple myeloma expression library screen. Jurkat (T-) cells transfected with the chimeric TCR served as bioindicators. Specific TCR crosslinking with an antigen results in MHC-independent effector cell activation, which can be monitored by cytokine ELISA. Here, expression of the WUE-1 specific TCR on grafted Jurkat cells was successfully demonstrated by triggering the interferon gamma (IFN-_) release by addition of Fc specific anti-human IgG antibody. However, IFN-_ could not be detected in co-cultures of transfected Jurkat effector cells and WUE-1 positive target cells. Although the molecular structure of the WUE-1 antigen is still unclear, it was shown that its expression profile and biochemical characteristics discriminate WUE-1 from other plasma cell-associated antigens described so far. Moreover, it was demonstrated that bssc-anti-Wue-1xCD3 induces efficient T-cell mediated cell death at low E:T ratios, and without any additional T-cell stimulation. WUE-1 therefore represents a very promising candidate for use in the development of novel immunotherapeutic treatment strategies of multiple myeloma.

Das Multiple Myelom (MM) ist ein klonaler B-Zell Tumor der differenzierten, langsam proliferierenden Plasmazelle, der hauptsächlich im Knochenmark lokalisiert ist. Das MM ist eine bislang unheilbare Erkrankung, mit einer mittleren Überlebensrate von 3-5 Jahren und ist verantwortlich für ca. ein Prozent aller krebsassoziierten Todesfälle in der Westlichen Welt. Die molekularen Ursachen, die dieser Krankheit zugrunde liegen sind jedoch noch nicht geklärt. Die Entwicklung immuntherapeutischer Strategien, im Besonderen von rekombinanten bispezifischen "single-chain" (bssc) Antikörpern, die außergewöhnliche biologische Eigenschaften besitzen welche sie von konventionellen Antikörpern unterscheiden, spielt daher eine wichtige Rolle in der Behandlung des MM. Die Entwicklung Antikörper basierter Therapieformen für die Behandlung des Multiplen Myeloms wird jedoch dadurch behindert, dass man bis dato keine geeigneten Plasmazell-spezifischen Oberflächenantigene kennt. Um neue, Plasmazell-spezifische Antikörper für dieses Projekt zu identifizieren wurden Hybridom-Überstände (generiert von Dr. Axel Greiner, Universität Würzburg) mittels Durchflußzytometrie mit einer Reihe von humanen MM-, Plasmazell-Leukaemie- und B-Zell-Lymphom Zelllinien untersucht. Drei Überstande zeigten ein positives Ergebnis mit der humanen MM Zelllinie RPMI-8226. Die in den Überständen enthaltenen Immunglobuline wurden als dem IgM-kappa Subtyp angehörend identifiziert. Western Blot (WB) Analyse identifizierte eine starke Bande von ca. 25kDa (genannt "MUE-1"). Auf einem zweidimensionalen (2D) Western Blot von RPMI-8226 Membranproteinen konnte ein einzelner Spot identifiziert, und mittels MALDI/MS analysiert werden. Analyse der Peptidsequenz und Datenbank Abgleich ergaben jedoch, dass es sich bei dem angeblich Plasmazell-spezifischen Antigen MUE-1 um lambda-leichte Kette handelte. Kürzlich wurde ein neuer monoklonaler Antikörper generiert, genannt "anti-Wue-1", der spezifisch an die Zelloberfläche von normalen und malignen humanen Plasmazellen bindet. Auf Basis dieses monoklonalen anti-Wue-1 Antikörpers konnte ein neuer, gegen MM Zellen gerichteter rekombinanter bssc Antikörper hergestellt werden, genannt "bssc anti-Wue-1xCD3". In einem Teilprojekt dieser Doktorarbeit wurden die biologischen Eigenschaften dieses neuen Konstruktes mittels der MM Zelllinie NCI-H929, oder primärer Myelom Zellen aus dem Knochenmark von Patienten, in Kombination mit autologen oder allogenen Effektor T-Zellen untersucht. In 10 von 11 Fällen konnte gezeigt werden, dass bssc anti-Wue-1xCD3 effizient den T-Zell vermittelten Zelltod von NCI-H929 als auch von primären MM-Zellen induzieren kann. Im Gegensatz zu konventionellen bispezifischen Antikörpern ist bssc anti-Wue-1xCD3 auch bei geringen Effektor zu Target (E:T) Verhältnissen wirksam und es ist keine zusätzliche T-Zell Stimulation nötig. Der Hauptteil dieser Doktorarbeit beschäftigte sich mit der Identifizierung, Klonierung und funktionellen Charakterisierung des WUE-1 Antigens. Zuerst wurden WUE-1 positive Zelllinien mittels Durchflußzytometrie identifiziert. Die weitere Charakterisierung des Antigens mit biochemischen Standard Methoden wie WB oder Immunpräzipitation (IP) schlug jedoch fehl. Daher wurde versucht das Antigen mit Hilfe von Expressionsklonierung und Immunselektion mit monoklonalem anti-Wue-1 Antikörper aus einer cDNA Expressionsbibliothek zu isolieren. Die isolierten Klone wurden sequenziert und mittels Northern Blot und Duchflußcytometrie analysiert. Es stellte sich jedoch heraus, dass alle Klone unspezifische DNA Fragmente trugen. Da die Effizienz des "single-chain" (sc) anti-Wue-1 Antikörpers und seine Vorteile gegenüber dem monoklonalen anti-Wue-1 bereits erfolgreich demonstriert werden konnten wurde beschlossen einen rekombinanten chimären T-Zell Rezeptor (TCR) zu generieren, bestehend aus der sc anti-Wue-1 Antikörper Domäne, einer humanen IgG Fc Sequenz, dem transmembranen Teil von CD28 und der intrazellulären CD3-zeta Signaldomäne. In einem modifizierten Immunselektions-Assay wurde eine MM cDNA Expressionsibliothek mittels anti- Wue-1 TCR expremierenden Effektor (Jurkat) Zellen untersucht, und über einen Interferon-gamma (IFN-g) ELISA analysiert. Die Expression des anti-Wue-1 TCR auf den Jurkat Zellen konnte erfolgreich demonstriert werden, indem die IFN-g Ausschüttung durch Zugabe von Fc-spezifischem, anti-humanem IgG aktiviert wurde. Es konnte jedoch kein IFN-g in den Co-Kulturen von transfizierten Jurkat Effektor Zellen und WUE-1 positiven Target Zellen (NCI-H929, ARH77) nachgewiesen werden. Obwohl die molekulare Struktur des WUE-1 Antigens weiterhin nicht aufgeklärt ist, konnte doch gezeigt werden, dass das Expressionsprofil und seine biochemischen Eigenschaften dieses Antigen von allen bisher beschriebenen Plasmazell-Antigenen unterscheidet. Weiterhin wurde demonstriert, dass bssc anti-Wue-1xCD3 bei geringem E:T Verhältnis und ohne zusätzliche T-Zell Stimulierung effizient den T-Zell vermittelten Zelltod auslöst. WUE-1 ist daher ein viel versprechender Ausgangspunkt für die Entwicklung neuer immuntherapeutischer Ansätze zur Behandlung des Multiplen Myeloms.