Der Wilms-Tumor-Transkriptionsfaktor WT1 ist essenziell für die Embryonalentwicklung verschiedener Organe, u.a. der Niere, und kann dabei seine Zielgene sowohl aktivieren als auch unterdrücken. Mutationen im WT1-Gen können zu gleichnamigen Tumoren der Niere, auch Nephroblastome genannt, führen. Welche Prozesse im Rahmen der Nierenentwicklung durch WT1 reguliert werden, ist noch nicht vollständig geklärt. Da Wt1-Knockout-Mäuse mit einer Nierenagenesie embryonal letal sind, ist eine molekulare WT1-Zielgenanalyse an ihnen nur sehr eingeschränkt möglich. Daher besteht das Ziel dieser Arbeit in der Etablierung eines In-vitro-Modells zur Identifizierung und funktionellen Charakterisierung neuer WT1-Zielmoleküle während der Nierenentwicklung. Hierzu wurden Nierenorgankulturen von Mausembryonen ex vivo kultiviert und die Wt1-Expression durch Inkubation mit einem antisense Vivo-Morpholino gehemmt. In einem genomweiten Ansatz wurde das Transkriptom in Nierenorgankulturen mit normaler und reduzierter Expression von Wt1 mittels Next Generation Sequencing (NGS) bestimmt und analysiert. Unter Verwendung weiterer zell- und molekularbiologischer Techniken wird das Homöobox-Gen HoxB9 im Rahmen dieser Arbeit als neues WT1-Zielgen beschrieben. HoxB9 ist als Mitglied der Hox-Genfamilie für die räumlich und zeitlich koordinierte Entwicklung und Ausrichtung der anterior-posterioren Körperlängsachse während der Embryonalentwicklung notwendig und wird stark in verschiedenen Tumorarten exprimiert. WT1 kann das HoxB9-Gen zelltypabhängig stimulieren und inhibieren. Die Hemmung von WT1 in ex vivo kultivierten murinen Nierenorgankulturen erhöht die HoxB9-Transkripte genauso wie ein siRNA-Knockdown von WT1 in den humanen, vom Nierenzellkarzinom abgeleiteten 786-0-Zellen und den mesonephrischen M15-Zellen der Maus. In Übereinstimmung mit der hemmenden Wirkung von WT1 auf die HoxB9-Expression werden beide Transkripte in einem sich nur marginal überlappenden Muster in embryonalen Mausnieren exprimiert. Im Gegensatz dazu erhöht WT1 die Expression von HoxB9 sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene in humanen, vom Osteosarkom abgeleiteten U2OS-Zellen sowie in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK293-Zellen). Die HoxB9-Promotoraktivität wird durch WT1 in transfizierten U2OS- und HEK293-Zellen stimuliert, aber in M15-Zellen gehemmt. Mittels Chromatin-Immunpräzipitationen (ChIP) und Elektromobilitäts-Shift-Assays (EMSA) konnte die Bindung von WT1 an den HoxB9-Promotor in U2OS- und M15-Zellen nachgewiesen werden. Ebenso ist BASP1, ein transkriptioneller Korepressor von WT1, mit dem HoxB9-Promotor im Chromatin dieser Zelllinien assoziiert. Eine Kotransfektion von U2OS- und HEK293-Zellen mit BASP1 hebt die stimulierende Wirkung von WT1 auf den HoxB9-Promotor auf. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe des genomweiten Ansatzes eine große Anzahl an Genen identifiziert werden, die entweder direkt oder indirekt durch WT1 reguliert werden. Je nach Zelltyp kann WT1 die Transkription von HoxB9 entweder stimulieren oder unterdrücken, wobei an der hemmenden Wirkung BASP1 beteiligt ist. Die Regulierung der HoxB9-Expression durch WT1 könnte sowohl während der Nierenentwicklung als auch der Tumorprogression relevant werden.
The Wilms' tumor transcription factor WT1 is essential for the embryonic development of various organs, including the kidney, and can both activate and suppress its target genes. Mutations in the Wt1 gene can lead to eponymous tumors of the kidney, also called nephroblastomas. It is not yet fully understood which processes are regulated by WT1 in the context of renal development. Since Wt1 knockout mice are embryonic lethal with agenesis of the kidney, they are of limited value for WT1 target gene analysis. Therefore, the aim of this work is to establish an in vitro model for the identification and functional characterization of new WT1 target molecules during renal development. For this purpose, Wt1 expression in murine ex vivo kidney organ cultures was inhibited by incubation with an antisense vivo-morpholino. In a genome-wide approach, the transcriptome of kidney organ cultures with normal and reduced Wt1 expression was analyzed by Next Generation Sequencing (NGS). Using further cellular and molecular biological techniques, the homeobox gene HoxB9 is described as a new WT1 target gene. HoxB9 is necessary for specification of the anterior-posterior body axis during embryonic development. WT1 can stimulate and inhibit the HoxB9 gene depending on the cell type. Silencing of Wt1 in kidney organ cultures increases HoxB9 mRNA levels as well as in human renal cell adenocarcinoma-derived 786-0 cells and murine mesonephric M15 cells. Consistent with the inhibitory effect of WT1 on HoxB9 expression, both transcripts are distributed in a mostly no-overlapping pattern in embryonic mouse kidneys. In contrast, WT1 increases HoxB9 mRNA and protein levels in human, osteosarcoma derived U2OS cells and in human embryonic kidney cells (HEK293 cells). HoxB9 promoter activity is stimulated by WT1 in transiently transfected U2OS and HEK293 cells but inhibited in M15 cells. The binding of WT1 to the HoxB9 promoter in U2OS and M15 cells was demonstrated by chromatin immunoprecipitation (ChIP) and electromobility-shift assays (EMSA). Similarly, BASP1, a transcriptional co-repressor of WT1, is associated with the HoxB9 promoter in the chromatin of these cell lines. Furthermore, co-transfection of U2OS and HEK293 cells with BASP1 represses the stimulatory effect of WT1 on the HoxB9 promoter. In summary, using the genome-wide approach this work identifies a large number of genes that are either directly or indirectly regulated by WT1. Depending on the cell type, WT1 can either stimulate or repress HoxB9, and the inhibitory effect involves BASP1. Regulation of HoxB9 expression by WT1 might become relevant during kidney development and cancer progression.
