Immunologisch-vermittelte, antikörper-mediierte endotheliale Läsionen tragen wesentlich zur Genese der konstituierenden pathogenen Vaskulopathie einer Transplantatnierenrejektion bei. Zwei Kennzeichen der Phänotypie dieser sind die intravaskuläre Koagulation sowie die Inflammation. Trotz bahnbrechender Neuerungen im Bereich medikamentöser Therapeutika, stellt die Therapie der Transplantatnierenrejektion sowohl Behandler als auch Behandelte weiterhin vor große Herausforderungen. Der Protease-aktivierte Rezeptor-1 (PAR-1) ist ein zunächst als Thrombinrezeptor identifizierter G-Protein-gekoppelter Rezeptor, welchem Beteiligungen sowohl an immunologischen als auch an inflammatorischen Prozessen zugeschrieben werden. Funktionelle, gegen den PAR-1 gerichtete Autoantikörper wurden erstmals bei Patientinnen mit primärem epithelialem ovariellem Karzinom nachgewiesen. Interessanterweise finden sich auch erhöhte PAR-1-Antikörpertiter bei Patienten mit Transplantatnierenrejektion. Mit dieser Arbeit wurde der Einfluss funktioneller Antikörper gerichtet gegen den PAR-1 sowie deren Wirkung auf Signaltransduktionsmechanismen und die endotheliale Inflammation anhand Interleukin-6 (IL-6) an humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen (HMEC-1) für die Pathologie einer Transplantatnierenrejektion untersucht. HMEC-1-Zellen wurden mit dem natürlichen PAR-1-Aktivator Thrombin und isolierten, gegen den PAR-1 gerichteten Antikörpern von Patienten mit Transplantatnierenrejektion stimuliert. Die Aktivierung der intrazellulären Signalwegskomponenten ERK 1/2, AKT sowie p70S6K wurde mittels Westernblot, die IL-6-Sekretion mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) bestimmt. Zur Bestätigung der Spezifität der nachgewiesenen Wirkungen wurden Inhibitoren bzw. Antagonisten eingesetzt. Die Wirkung isolierter PAR-1-Antikörper wurde durch Neutralisation mit einer synthetischen Peptidsequenz der 2. extrazellulären Schleife (ECL 2) des PAR-1 demonstriert. Der endogene PAR-1-Aktivator Thrombin induzierte eine konzentrations- und zeitabhängige Phosphorylierung von ERK 1/2. Für AKT und p70S6K deutete sich diese an. PAR-1-Antikörper-positive Immunglobulineluate von Patienten mit Transplantatnierenrejektion (Tx-IgG) stimulierten die Aktivierung von ERK 1/2 tendenziell unabhängig von Thrombin. Dies deutete sich ebenso für die weiteren untersuchten Signalwegskomponenten an. Eine spezifische pharmakologische Blockade bestätigte die PAR-1-Aktivierung von ERK 1/2. Zeigen ließ sich weiterhin, dass PAR-1-Antikörper eine erhöhte Sekretion von IL-6 bedingten, welche unter Beteiligung von ERK 1/2 erfolgte. Zusammenfassend wurde mit der vorliegenden Arbeit erstmalig gezeigt, dass gegen den PAR-1-gerichtete Antikörper an pathologischen endothelialen Prozessen der Transplantatnierenrejektion mitwirken und über IL-6 die endotheliale Inflammation unterhalten.
Antibodies (AB) may provoke endothelial lesions in renal allograft rejections (RAR) resulting in a characteristic constituting pathogenic vasculopathy. The phenotype of rejected renal allografts is characterized by intravascular coagulation and inflammation. Despite pioneering pharmaceutical developments RAR still outlines a tremendous challenge for clinicians as well as patients to the present day. The Protease-activated receptor 1 (PAR-1), originally titled as „thrombin receptor“, is a G-protein-coupled receptor (GPCR) contributing to immunological and inflammatory processes. Functional antibodies against PAR-1 were firstly detected in patients with primary epithelial ovarian cancer. Interestingly, increased PAR-1-AB-levels have also been proven in the serum of RAR patients. Aim of this thesis was to investigate the influence of functional antibodies against the GPCR PAR-1 and their impact on intracellular signaling pathways as well as on the secretion of interleukin-6 (IL-6) as marker for endothelial inflammation in human dermal microvascular endothelial cells (HMEC-1) in the context of RAR. HMEC-1-cells were treated with the endogenous PAR-1-activator thrombin and PAR-1-AB-positive immunoglobulin eluates isolated from patients with RAR. The activation of ERK 1/2, AKT as well as p70S6K were detected by western blotting, IL-6-secretion was measured by enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA). The specificity of the determined effects was confirmed by experiments using specific inhibitors and PAR-1-antagonists. The impact of the isolated PAR-1-AB was demonstrated by neutralisation with a synthetical peptide of the second extracellular loop (ECL 2) of the PAR-1. Thrombin induced the phosphorylation of ERK 1/2 in a concentration- and time-dependent manner. Equaling hints were also present for AKT and p70S6K. PAR-1-AB-positive immunoglobulin eluates indicated an activation of ERK 1/2 independent from Thrombin. These indications were also hinted for AKT and p70S6K. Specific pharmacological blockage validated the PAR-1 activation. Furthermore an increased ERK 1/2-regulated IL-6-secretion was induced by PAR-1-AB. In conclusion, this is the first evidence that PAR-1-AB contribute to pathological endothelial processes in renal allograft rejections and may maintain endothelial inflammation by IL-6.
