Die Autophagie ist ein evolutionär konservierter zellulärer Wiederaufbereitungs-mechanismus, der zelleigene Makromoleküle und Organellen in seine Grundbausteine zerlegt und dem Zellmetabolismus zur Wahrung der Zellhomöostase wieder zur Verfügung stellt. Dies geschieht durch Einschluss der Zielstrukturen in eine Doppelmembranstruktur, das Autophagosom, und mittels konsekutiver Fusion des Autophagosoms mit einem degradativen Lysosom. Nervenzellen gehören aufgrund ihres postmitotischen Zustandes sowie hoher metabolischer Aktivität zu jenen Zelltypen, die besonders auf die Autophagie angewiesen sind. Deshalb lässt sich eine Neurodegeneration durch eine Ausschaltung der basalen neuronalen Autophagie auslösen. Aus diesem Grund gerät die Autophagie im Kontext akuter und chronischer Stressreize zunehmend in den wissenschaftlichen Fokus. Gleichwohl sind die quantitativen Variationen der Autophagiekapazität verschiedener Nervenzelltypen bisher ein unbearbeitetes Gebiet in der Autophagieforschung. Diese Variationen sind von besonderem Interesse, weil viele Erkrankungen des Nervensystems zumindest initial einen selektiven Befall bestimmter Nervenzelltypen zeigen und Variationen in der Autophagiekapazität eine Grundlage für eine differenzielle Vulnerabilität verschiedener Neuronentypen darstellen können. Die hirnorganotypische Schnittkultur ist zur Untersuchung dieser Frage vorteilhaft, weil sie das organotypische Mikromilieu mit einer leichten Zugänglichkeit und einer Manipulierbarkeit der äußeren Umstände kombiniert. Im Rahmen der vorliegenden Untersuchung wurde die cerebelläre organotypische Schnittkultur als experimentelles System für den zelltypspezifischen quantitativen Vergleich neuronaler Autophagie etabliert und anhand eines Teils des Autophagieapparates getestet, der Autophagosomenformation. Hierzu wurden [1] ein Vergleich zwischen cerebellären Schnittkulturen und nativem Kleinhirngewebe aus altersentsprechenden Mäusen, [2] eine Untersuchung der Entwicklung des Autophagiestatus über die Kulturdauer hinweg sowie [3] eine Verifizierung der allgemeinen Responsivität der Schnittkulturen auf in der Autophagieforschung gängige Methoden der Manipulation des Autophagiestatus in orientierenden Western Blot-Untersuchungen durchgeführt. Anschließend erfolgte ein zellspezifischer immunhistochemischer Vergleich zwischen Purkinje-Zellen und Parvalbumin-positiven Interneuronen jeweils nach Behandlungen mit dem etablierten Pharmakon Bafilomycin, das die Degradation von Autophagosomen inhibiert. Die so entstandene Akkumulation von LC3B-positiven Autophagosomen wurde als Ausdruck der Autophagosomenformation gewertet und zwischen den Zelltypen verglichen. Die Ergebnisse zeigen dabei einen deutlichen absolut Unterschied in der basalen Autophagosomenbildung zwischen den Zelltypen, der maßgeblich mit der Somagröße korreliert, sowie eine zelltypübergreifende relative Kinetik der Autophagosomenbildung der untersuchten Neuronen im gleichen organotypischen Mikromilieu.
Autophagy is an evolutionarily highly conserved cellular recycling mechanism which degrades macromolecules and organelles in order to supply cell metabolism with nutrients and maintain cellular homeostasis. This is achieved by enclosing target structures in autophagosomes and their consecutive fusion with degradative lysosomes. Postmitotic neurons are particularly dependent on autophagy due to their high metabolic activity. Additionally, neurons are not able to dilute damaged organelles or aggregated macromolecules by mitosis. Consequently, experimentally induced impairment of autophagy leads to neurodegeneration. The basal role of autophagy in cellular homeostasis focuses scientific attention on autophagy as either risk factor or compensating mechanism for both acute and chronic cellular stress. However, knowledge about quantitative variations in autophagic capacities among cell types largely remain a “blind spot”. Such variations may lead to a selective vulnerability of specific cell types and provide an explanation for the fact that a wide range of diseases of the central nervous system initially manifest in a distinct pattern of cell affliction. The brain organotypic slice culture assay provides a convenient model for investigation of cell type specific differences because it combines an organotypic micro-milieu with an easy accessability and manipulability of external circumstances. This study establishes a cerebellar organotypic slice assay as experimental model for quantitative cell type specific analysis of neuronal autophagy and applies this assay to the quantitative investigation of autophagosome formation. The following basic parameters were established using Western Blot assays: firstly, a comparison of cerebellar slices with samples directly obtained from mice was carried out; secondly, the influence of duration of cultivation was investigated; thirdly, the responsivity of cerebellar slices to commonly used methods for manipulation of autophagy was confirmed. Afterwards, an immunohistochemical comparison of purkinje cells and parvalbumin-positive interneurons after treatment with bafilomycin, which inhibits autophagosome degradation, was conducted. The consecutive accumulation of LC3B-positive Autophagosomes was analyzed as measure for autophagosome formation and compared between cell types. Results showed a marked absolute difference in autophagosome formation between cell types as well as analogous kinetics in the same organotypic micro-milieu.
