Maintenance of the osmotic homeostasis by arginin-vasopressin (AVP) mediated antidiuresis requires the coordinated action of renal epithelial and vascular structures. In the thick ascending limb of the loop of Henle, AVP increases the transport activity of the Na+, K+, 2Cl- cotransporter (NKCC2), thereby enabling the generation of the osmotic gradient necessary for urine concentration. AVP also reduces renal medullary blood flow by causing vasoconstriction of glomerular arterioles and descending vasa recta in order to control the gradient. Locally produced epoxyeicosatrienoic acid (EET) regioisomers inhibit TAL transport activity and cause vasodilation of the renal microvasculature to counteract the effects of AVP. We hypothesized that AVP has a regulatory function in determining renal EET levels. To this end we used Brattleboro rats with central diabetes insipidus (DI) due to a hereditary loss-of-function mutation in the AVP-gene. Animals were treated for 3 days with the selective AVP type-2 receptor agonist desmopressin (dDAVP; 5ng/h) to study medullary EET levels by mass spectrometry-based lipidome analysis. Medullary gene expression was analyzed by an Affymetrix mRNA microarray. Treatment of DI rats with dDAVP resulted in the expected drop in urine flow along with increased NKCC2 mRNA (+130 ± 7 %, p<0,05) and protein (+70 ± 5%, p<0,05) levels. Regioisomers of EET were decreased (5,6-EET, -56 ± 3%; 11,12-EET, -50 ± 3,4%; and 14,15-EET, -60 ± 3,7%; p<0,05). Calcium-independent group VIA phospholipase A2 (iPLA2), which reflects EET synthesis, was significantly reduced (mRNA, -30 ± 3; protein, -65 ± 7%; p<0,05), and soluble epoxide hydrolase (sEH), the primary EET-degrading enzyme, was increased (mRNA, +160 ± 37%; protein, +120 ± 26%; p<0,05). The presence of both enzymes in ADH-sensitive nephron segments was confirmed by immunolocalization studies. Functional relevance of 14,15-EET for TAL transport activity was demonstrated in microperfusion studies of isolated murine TAL segments. Administration of 14,15-EET (1μmol/l) resulted in a significant reduction of transport activity as a function of ambient chloride concentration (-30% at 147 mmol/l Cl, -70% at 30 mmol/l Cl). Furthermore, treatment of cultured rat TAL cells with selective iPLA2 inhibitor (S)-bromoenol lactone (S-BEL; 5μmol/l 1h) increased phosphorylation (+189 ± 6%, p<0,05) and membrane insertion of NKCC2. In sum, these results demonstrate an inhibitory effect of AVP on renal EET levels which may result from their decreased synthesis and augmented degradation. Downregulation of iPLA2 and activation of sEH may therefore contribute to ADH-mediated antidiuresis.
Die Aktivierung der Harnkonzentrierung durch das antidiuretische Hormon (ADH) erfordert die Koordination renaler, epithelialer und vaskulärer Strukturen. Im dicken aufsteigenden Ast der Henle Schleife (TAL) stimuliert ADH die Transportaktivität des Na+, K+, 2Cl- Kotransporters (NKCC2). Dadurch wird in der Medulla der Aufbau eines osmotischen Gradienten im Interstitium ermöglicht, welcher die treibende Kraft für die anschließende Wasserresorption im Sammelrohr darstellt. ADH bewirkt weiterhin eine Vasokonstriktion der glomerulären Arteriolen und absteigenden Vasa recta. Die resultierende Reduktion des medullären Blutflusses verhindert ein Auswaschen des osmotischen Gradienten. Lokal generierte Regioisomere der Epoxyeicosatriensäure (EET) können antagonistische Effekte zu ADH entfalten, indem sie die Transportaktivität des TAL hemmen und eine Vasodilatation renaler Widerstandsgefäße auslösen. Hier wurde die Hypothese geprüft, dass ADH eine regulierende Funktion für die lokalen EET-Spiegel ausübt. Ratten mit hereditärem zentralen Diabetes insipidus (DI) wurden für 3 Tage mit dem ADH V2-Rezeptoranalog Desmopressin (dDAVP; 5ng/h) behandelt. Die Messung medullärer EET-Gewebekonzentrationen erfolgte mittels Massenspektrometrie. Die medulläre Genexpression wurde durch Affymetrix mRNA-Microarray untersucht. Die Behandlung von DI-Ratten mit dDAVP führte zur Reduktion der Diurese. Gleichzeitig war die Expression von NKCC2 auf mRNA (+130 ± 7 %, p<0,05) und Proteinebene (+70 ± 5%, p<0,05) erhöht. Die EET-Gewebekonzentration war dagegen signifikant reduziert (5,6-EET: -56 ± 3%; 11,12-EET: -50 ± 3,4%; 14,15-EET: -60 ± 3,7%; p<0,05). Die Microarray Analyse zeigte eine signifikante Reduktion der Kalzium-unabhängigen Phospholipase A2 Gruppe VIA (iPLA2). Dies konnte über Real time PCR (-30 ± 3%, p<0,05) und Western blot (-65 ± 7%, p<0,05) bestätigt werden. Epoxidhydrolase (sEH), die den EET-Abbau katalysiert, war gesteigert (mRNA: +160 ± 37%, Protein: +120 ± 26%; p<0,05). Beide Enzyme wurden immunhistochemisch in ADH-sensitiven Nephronsegmenten lokalisiert. Der Einfluss von 14,15-EET auf die TAL-Transportaktivität wurde durch Mikroperfusionsstudien an isolierten TAL-Segmenten der Maus untersucht. Hier führte die Behandlung mit 14,15-EET (1μmol/l, 30 min) zu einer signifikanten Reduktion der Transportaktivität in Abhängigkeit von der umgebenen Chloridkonzentration (-30% bei 147 mmol/l Cl, -70% bei 30 mmol/l Cl). Eine selektive Inhibition von iPLA2 mit S-Bromoenol Lacton (S-BEL; 5μmol/l 1h) in kultivierten medullären TAL-Zellen der Ratte führte zu einer Zunahme der aktivierenden Phosphorylierung von NKCC2 (+189 ± 6%, p<0,05) und bewirkte die Membraninsertion des Proteins. Zusammenfassend zeigen diese Befunde zum ersten Mal einen inhibitorischen Effekt von ADH auf die Gewebekonzentration von EET. Die Reduktion von EET ist dabei sowohl auf eine verminderte Synthese als auch auf einen vermehrten Abbau zurückzuführen. Die ADH-abhängige Regulation von iPLA2 und sEH stellt damit einen neuen Mechanismus der ADH-induzierten Harnkonzentrierung dar.
