In modern medicine therapeutic hypothermia (TH) has proven worth for organ protection after ischemic events. Multiple mechanisms of hypothermia have been explored, whereas the cellular and molecular kinetics of rewarming and reactive fever upon hypothermia remain to be elucidated. Therefore, this study aims to investigate the induction of inflammation and cell death by fever following hypothermia in ischemia/reperfusion injured cardiomyocytes.
Murine HL-1 cardiomyocytes underwent an oxygen-glucose deprivation/reperfusion (OGD/R) for six hours. Intra-OGD hypothermia (33.5 °C) was initiated after three hours and maintained for 24 hours, followed by warming to normothermia (37 °C) or fever (40 °C) for an additional 24 hours. LDH was measured in supernatant as marker for necrosis. Protein-concentrations of cleaved Caspase 3 as apoptosis marker and protective cold-shock protein RBM3 were assessed by Western Blot. QRT-PCR was used to determine mRNA transcriptions of RMB3, oxidative stress marker iNOS, and pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-6, IL-1β, SOCS3, COX-2, and MCP-1.
During OGD significantly elevated iNOS transcription was observed. This induction of iNOS continued throughout reperfusion and rewarming in uncooled but not in cooled OGD/R groups. Correspondingly, hypothermia inhibited a significant increase in LDH during late reperfusion phase. Right after OGD cytokine transcriptions were suppressed. In early reperfusion a significant spike in TNF-α transcription was seen in both cooled and uncooled cardiomyocytes. Whereas during late reperfusion significant increases in TNF-α, IL-6, IL-1β, and SOCS3 transcripts were observed, but were not elevated by cooling and rewarming. Upon further warming to fever cytokine transcriptions were significantly augmented in OGD/R-injured cells. These were partially attenuated by TH and not observable in the undamaged 40 °C control. Expression of RBM3 mRNA and protein was significantly induced by hypothermia throughout rewarming, and suppressed by fever. Correspondingly, fever led to increased cleavage of Caspase 3 in OGD/R-injured cardiomyocytes and 40 °C control.
Therapeutic hypothermia is an effective strategy to reduce necrotic and apoptotic cell death, oxidative stress, and inflammatory reactions after ischemia/reperfusion-induced injury in cardiomyocytes. Rewarming to 37 °C did not cause any adverse effects. However, fever negates these protective effects and aggravates both inflammation and apoptosis. Therefore, mitigating fever is essential to reducing ischemia/reperfusion-induced tissue damage.
Die therapeutische Hypothermie (TH) hat sich in der modernen Medizin zur Organprotektion nach ischämischen Ereignissen bewährt. Zahlreiche Wirkmechanismen der Kühlung wurden bereits untersucht, die zellulären und molekularen Mechanismen von Wiedererwärmung und reaktivem Fieber nach Kühlung bedürfen jedoch noch weiterer Forschung. Daher vertieft diese Arbeit die Effekte von Hypothermie mit anschließendem Fieber auf die Induktion von Inflammation und Zelltod in Ischämie/Reperfusion-geschädigten Kardiomyozyten.
Murine HL-1 Kardiomyozyten wurden einem Sauerstoff-Glukose-Entzug mit anschließender Reperfusion (oxygen-glucose-deprivation/reperfusion, OGD/R) für sechs Stunden unterzogen. Nach drei Stunden wurde eine intra-OGD Hypothermie (33,5 °C) initiiert und für 24 Stunden aufrechterhalten. Anschließend wurden die Zellen für weitere 24 Stunden auf Normothermie (37 °C) oder auf Fieber (40 °C) erwärmt. Als Marker für Nekrose wurde LDH im Überstand gemessen. Proteinkonzentrationen von aktivierter Caspase 3 für Apoptose und dem protektiven Kälteschock-Protein RBM3 wurden durch Western Blot ermittelt. Die mRNA-Transkriptionen von RBM3, von iNOS für oxidativen Stress und den pro-inflammatorischen Zytokinen TNF-α, IL-6, IL-1β, SOCS3, COX-2 und MCP-1 wurden durch RT-qPCR bestimmt.
Während der OGD zeigte sich signifikant ¬¬gesteigertes iNOS. Dieser Anstieg von iNOS blieb auch nach Reperfusion und Wiedererwärmung in der ungekühlten OGD/R-Gruppe, nicht aber in der Gekühlten bestehen. Entsprechend inhibierte Hypothermie eine signifikante Erhöhung der LDH Konzentration während der späten Reperfusionsphase. Direkt nach der OGD waren die Zytokin-Transkriptionen gehemmt. In der frühen Reperfusionsphase konnte ein signifikanter Anstieg von TNF-α in gekühlten und ungekühlten Kardiomyozyten ausgelöst werden. Während in der späteren Reperfusionsphase die Transkriptionen von TNF-α, IL-6, IL-1β und SOCS3 in der ungekühlten OGD/R-Gruppe signifikant erhöht waren, konnten Kühlung und Widererwärmung auf 37 °C keinen Anstieg bewirken. Dagegen wurde ein deutlicher signifikanter Anstieg der Zytokine durch die weitere Erwärmung OGD/R-geschädigter Zellen auf Fieber beobachtet. Dieser konnte zum Teil zu Beginn des Fiebers durch eine vorausgegangene Hypothermie inhibiert werden und war nicht in der ungeschädigten 40 °C Kontrolle zu sehen. Die mRNA- und Protein-Expression von RBM3 konnte durch Hypothermie auch über die Wiedererwärmung hinaus signifikant induziert und durch Fieber gehemmt werden. In Korrelation dazu steigert Fieber in OGD/R-geschädigten Kardiomyozyten und in der 40 °C Kontrolle die aktivierte Caspase 3.
TH stellt nach OGD/R-Schädigung in Kardiomyozyten eine effektive Strategie zur Reduktion von nekrotischem und apoptotischen Zelltod, oxidativen Stress und einer Inflammationsreaktionen. Die Wiedererwärmung auf 37 °C konnte keine aversiven Effekte auslösen. Jedoch hebt Fieber die Protektion der Hypothermie auf und aggraviert sowohl Inflammation als auch Apoptose, sodass die Fiebervermeidung zur Reduktion des Zelluntergangs essentiell ist.
