For efficacious adoptive T cell therapy (ATT), the appropriate selection of tumor-specific antigens (TSAs) is crucial. Recurrent somatic driver mutations yield ideal TSAs for ATT to achieve complete tumor elimination, possibly without relapse. In silico algorithms predict epitopes as TSAs for ATT, however, with low probability. Thus, the accuracy of prediction algorithms still needs validation in describing processed neoepitopes. Simultaneous validation of proteasomal processing of predicted TSAs and identification of neoantigen-specific T cell receptors (TCRs) is possible from transgenic mice. One such model developed by Li et al. in 2010 was the ABabDII mice having the complete human TCR gene loci, knocked out for murine TCR and MHC class I gene loci, and it is transgenic for human HLA class I allele, HLA-A*02:01 (HLA-A2). Though isolation of human TCRs is possible from ABabDII mice, the model is limited as a source of obtaining only HLA-A2-restricted TCRs, thereby restricting epitope identification to HLA-A2 antigens. In this doctoral study, a novel mouse model with six human HLA alleles as a single haplotype, named ABab.I, was developed on ABabDII background to diversify HLA genes in the existing ABabDII mice for epitope discovery and broaden TCR repertoire for non-HLA-A2 restricted TCR isolation. In silico screening for putative neoepitopes predicted to bind high-ranked HLA alleles selected the six alleles in ABab.I mice; novel class I haplotype like in humans as every individual bears six HLA class I alleles. Initially, the in silico screening predicted 23 and 152 high-affinity TSAs (IC50 < 50 nM) from recurrent point mutations (n=266) that bound HLA-A2, and other frequent class I alleles (n=18), respectively. In the first phase of this doctoral thesis, epitope immunogenicity was tested in 4 out of 23 HLA- A2-binders in ABabDII mice. Only 1 out of 4 immunized epitopes elicited CD8+ T cell (CTL) responses. However, this was confirmed to be not endogenously processed when tested with TCRs raised from ABabDII mice. This form of reverse immunology is laborious and still a concern with open questions. A previous study on identifying epitopes from the vaccinia virus by Assarsson et al. in 2007 aligns with the in silico screen predicted data examined in this thesis. Thus, prediction algorithms offer a low probability to select immunogenic epitopes. In the second phase, the ABab.I mouse model with a novel set of chimeric class I fusion alleles, HLA-A*03:01, A*11:01, B*07:02, B*15:01, C*04:01, and C*07:02, was developed using PiggyBac transposon strategy. The introduction of six HLA alleles as a single genotype resembling a natural human situation broadened the TCR repertoire four-fold by enriching the peripheral pool with five times more unique and rarer V(D)J-TCRß clonotypes than ABabDII mice. Ultimately, ABab.I mice would serve as a versatile in vivo model system for epitope discovery, besides being a valuable tool to identify novel TCRs against high HLA-affinity tumor-specific antigens (IC50 < 50 nM) derived from recurrent somatic point mutations.
Für eine wirksame adoptive T-Zell-Therapie (ATT) ist die Wahl geeigneter tumorspezifischer Antigene (TSAs) entscheidend. Sogenannte „Treiber-Mutationen“ - somatische Mutationen, die an der Tumorentstehung beteiligt sind und gehäuft in Tumoren auftreten, stellen ideale TSAs für eine ATT mit dem Ziel einer vollständigen Tumoreliminierung, und bestenfalls ohne Rückfall, dar. In silico-Algorithmen können Epitope als TSAs für die ATT vorhersagen, jedoch nur mit geringer Wahrscheinlichkeit. Eine experimentelle Validierung dieser Vorhersagen und Bestätigung tatsächlich prozessierter Neoepitope ist somit weiterhin notwendig. Die gleichzeitige Validierung der Prozessierung vorhergesagter TSAs und die Isolierung neoantigenspezifischer T-Zell-Rezeptoren (TCRs) ist in transgenen Mäusen möglich. Ein solches transgenes Model ist die ABabDII-Maus, die von Li et al. entwickelt wurde. Diese verfügt über die vollständigen humanen TCR-Genloci sowie eines knock-out der murinen TCR- und MHC-Klasse-I-Loci und ist transgen für das humane HLA-Allel A*02:01 (HLA-A2). Auch wenn die Isolierung von humanen TCRs aus den ABabDII-Mäusen möglich ist, ist das Modell auf HLA-A2-restringierte TCRs und die Identifikation HLA-A2-bindender Epitope begrenzt. In dieser Arbeit wurde ein neues Modell (ABab.I) mit einem einzelnen Haplotyp bestehend aus sechs humanen HLA-Allelen auf Basis der ABabDII-Maus entwickelt, um die Identifikation von neuen nicht-HLA-A2-restringierten Epitopen und TCRs zu ermöglichen. Durch in silico- Screening nach mutmaßlichen Neoepitopen, denen eine Bindung an häufig vorkommende HLA-Allele vorhergesagt wurde, wurden die sechs Allele der ABab.I-Maus ausgewählt; ein neuartiger Klasse-I-Haplotyp mit, wie im Menschen vorkommend, sechs HLA-Klasse-I-Allelen. Zunächst wurden durch das in silico-Screening 23 und 152 hochaffine TSAs (IC50 < 50 nM) aus gehäuft in Tumoren auftretenden Punktmutationen (n=266) vorhergesagt, die HLA-A2 oder andere häufige Klasse-I-Allele (n=18) binden. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Immunogenität von vier der 23 HLA-A2-Binder in ABabDII-Mäusen getestet. Nur eines von vier immunisierten Peptiden löste eine CD8+ T-Zell- Antwort aus. Eine Testung mit aus ABabDII-Mäusen isolierten TCRs ergab jedoch, dass dieses Epitop nicht endogen prozessiert wird. Diese Form der reversen Immunologie ist aufwendig und hinterlässt häufig offene Fragen. Die Vorhersagealgorithmen bieten daher eine zu geringe Wahrscheinlichkeit, immunogene Epitope zu identifizieren. Im zweiten Teil wurde das ABab.I-Mausmodell mit einem neuartigen Satz von chimären Klasse-I-Fusionsallelen – HLA-A*03:01, A*11:01, B*07:02, B*15:01, C*04:01, und C*07:02 – mit Hilfe der PiggyBac-Transposon-Strategie entwickelt. Die Einführung von sechs HLA- Allelen erweiterte das TCR-Repertoire um das Vierfache, der periphere T-Zell-Pool enthielt fünfmal mehr einzigartige und seltenere V(D)J-TCRß-Klonotypen als der in ABabDII-Mäusen. Die ABab.I-Mäuse können als vielseitiges in vivo-Modellsystem für die Entdeckung von Epitopen dienen und darüber hinaus ein wertvolles Werkzeug zur Isolierung neuartiger TCRs gegen tumorspezifische Antigene mit hoher HLA-Affinität (IC50 < 50 nM) sein.
