Different physical cues are known to affect mesenchymal stem cell (MSC) behavior, indicating a complex relationship between the cell and its microenvironment. Mechanical strain and temperature changes are examples of cues that are relevant in vitro and in vivo. However, the combined effects of multiple physical cues on MSCs remained unclear. Traditional mechanical devices used in cell research have limitations on the integration of various factors and high-throughput applications. The requirement of new biomaterials to integrate the multiple external stimuli was arising to figure out the complex cellular mechanisms. The thermoresponsive mechanical strain was investigated to achieve the aim of using active biomaterials to study the combined effects on human MSCs. Poly (ℇ-caprolactone)-butyl acrylate (PCL-BA) copolymer sheet actuators were programmed so that the reversible shape change could be controlled by temperature changes between 37 °C and 10 °C. A thermochamber was used to culture the human adipose-derived stem cells (ADSCs) on the shape-memory polymer sheet actuators. 50 × 50 µm grids were created on the underside of the actuator sheets to observe the shape change of polymer and cells. Cell morphology, orientation, and migration were observed and recorded using time-lapse microscopy. The dual stimuli of temperature change and mechanical strain were translated into intracellular signals, such as calcium oscillation and nuclei translocation of the mechanical sensors, which were characterized using chemical reagents and immunostaining. Further, epigenetic histone modification of hADSCs was analyzed using chromatin immunoprecipitation quantitative real-time PCR (ChIP-qPCR). Finally, adipogenesis and osteogenesis of the hADSCs were studied to evaluate MSC differentiation capacity with the combined physical cues. The effect of temperature changes on adipocyte dedifferentiation was demonstrated by quantifying lipid accumulation in mature adipocytes. The expression of lipid accumulation-related genes and cell proliferation capacity were analyzed to investigate the dedifferentiation properties. In this work, the PCL-BA shape-memory polymer actuator elongated more than 10% at 10 °C, and contracted when returned to 37 °C. The mechanical strain was generated with the polymer actuator's elongation, which modified the cell morphology and increased cell migration. The periodic temperature change and mechanical strain induced calcium influx into cells; meanwhile, the mechanical strain promoted nuclei translocation of the YAP and RUNX2. The dual stimuli further increased the epigenetic acetylation of histone H3 lysine 9 (H3K9ac) and enhanced the expression level of osteogenesis-related genes and proteins. In addition, the dual stimuli of temperature change and mechanical strain induced the focal adhesion activation by regulation of integrin and myosin light chain (MLC) phosphorylation. As a result, cytoskeleton organization and focal adhesion activation were reduced by pretreatment of the MSCs with temperature changes but enhanced with mechanical strain changes. Temperature change alone decreased the cell migration velocity on SMPA substrate, while temperature change and mechanical strain combined increased cell migration velocity. Further, the cyclic temperature change (10 - 37 °C) decreased intracellular lipid of mature adipocytes and increased free fatty acids (FFA) outside. Simultaneously, mature adipocyte marker FABP4 was significantly down-regulated, while the brown adipocyte-related genes UCP1, PGC-1α, and PRDM16 were up-regulated. Ki67 represents the proliferation marker that was increased after the treatment of temperature change. The transformation of mature adipocytes and increasing proliferation capacity indicates the promotion of adipocyte dedifferentiation. The shape-memory polymer actuator sheet is an active biomaterial that can generate mechanical strain with simple temperature control. This artificial muscle allows the combined influence of multiple physical cues on stem cells to be studied. We found the combinative effects of the interplay of mechanical and temperature stimuli on MSC behavior and lineage commitment change, instead of the typical single effect on MSCs. We also established the adipocyte dedifferentiation with periodic temperature changes, which might be used to generate alternative stem cell sources and improve the MSC-based cell therapy in regenerative medicine.
Verschiedene physikalische Hinweise das Verhalten mesenchymaler Stammzellen (MSC) beeinflussen, was auf eine komplexe Beziehung zwischen der Zelle und ihrer Mikroumgebung hindeutet. Mechanische Belastung und Temperaturänderungen sind Beispiele für Hinweise, die in vitro und in vivo relevant sind. Die kombinierten Auswirkungen mehrerer physischer Hinweise auf MSCs blieben jedoch unklar. Herkömmliche mechanische Geräte, die in der Zellforschung verwendet werden, haben Einschränkungen bei der Integration verschiedener Faktoren und Anwendungen mit hohem Durchsatz. Um die komplexen zellulären Mechanismen zu verstehen, entstand der Bedarf an neuen Biomaterialien, um die vielfältigen externen Reize zu integrieren. Die thermoresponsive mechanische Belastung wurde untersucht, um das Ziel zu erreichen, aktive Biomaterialien zu verwenden, um die kombinierten Wirkungen auf menschliche MSCs zu untersuchen. Aktuatoren aus Poly(ℇ-caprolacton)-butylacrylat (PCL-BA)-Copolymer wurden so programmiert, dass die reversible Formänderung durch Temperaturänderungen zwischen 37 °C und 10 °C gesteuert werden konnte. Eine Thermokammer wurde verwendet, um die humanen Fettstammzellen (ADSCs) auf den Formgedächtnis-Polymerplattenaktoren zu kultivieren. Auf der Unterseite der Aktorplatten wurden 50 × 50 µm Raster erzeugt, um die Formänderung von Polymer und Zellen zu beobachten. Zellmorphologie, Orientierung und Migration wurden beobachtet und unter Verwendung von Zeitraffermikroskopie aufgezeichnet. Die dualen Stimuli von Temperaturänderung und mechanischer Belastung wurden in intrazelluläre Signale wie Calciumoszillation und Kerntranslokation der mechanischen Sensoren übersetzt, die mit chemischen Reagenzien und Immunfärbung charakterisiert wurden. Darüber hinaus wurde die epigenetische Histonmodifikation von hADSCs mittels quantitativer Chromatin-Immunpräzipitations-PCR (ChIP-qPCR) analysiert. Schließlich wurden Adipogenese und Osteogenese der hADSCs untersucht, um die Differenzierungskapazität von MSCs mit den kombinierten physikalischen Hinweisen zu bewerten. Die Wirkung von Temperaturänderungen auf die Dedifferenzierung von Adipozyten wurde durch die Quantifizierung der Lipidakkumulation in reifen Adipozyten gezeigt. Die Expression von Lipidakkumulations-bezogenen Genen und die Zellproliferationskapazität wurden analysiert, um die Dedifferenzierungseigenschaften zu untersuchen. In dieser Arbeit dehnte sich der PCL-BA-Formgedächtnis-Polymeraktor bei 10 °C um mehr als 10 % aus und zog sich bei Rückkehr auf 37 °C zusammen. Die mechanische Spannung wurde durch die Dehnung des Polymeraktors erzeugt, was die Zellmorphologie veränderte und die Zellmigration verstärkte. Die periodische Temperaturänderung und die mechanische Belastung induzierten einen Calciumeinstrom in die Zellen; währenddessen förderte die mechanische Belastung die Kerntranslokation von YAP und RUNX2. Die dualen Stimuli erhöhten die epigenetische Acetylierung von Histon H3 Lysin 9 (H3K9ac) weiter und erhöhten das Expressionsniveau von Osteogenese-bezogenen Genen und Proteinen. Darüber hinaus induzierten die dualen Stimuli von Temperaturänderung und mechanischer Belastung die fokale Adhäsionsaktivierung durch Regulation der Integrin- und Myosin-Leichtketten-(MLC)-Phosphorylierung. Als Ergebnis wurden die Zytoskelett-Organisation und die fokale Adhäsionsaktivierung durch die Vorbehandlung der MSCs mit Temperaturänderungen reduziert, aber durch mechanische Belastungsänderungen verstärkt. Die Temperaturänderung allein verringerte die Zellmigrationsgeschwindigkeit auf dem SMPA-Substrat, während Temperaturänderung und mechanische Belastung kombiniert die Zellmigrationsgeschwindigkeit erhöhten. Darüber hinaus verringerte die zyklische Temperaturänderung (10 - 37 °C) das intrazelluläre Lipid reifer Adipozyten und erhöhte die freien Fettsäuren (FFA) außerhalb. Gleichzeitig wurde der reife Adipozytenmarker FABP4 signifikant herunterreguliert, während die braunen Adipozyten-verwandten Gene UCP1, PGC-1α und PRDM16 hochreguliert wurden. Ki67 stellt den Proliferationsmarker dar, der nach der Behandlung der Temperaturänderung erhöht war. Die Transformation reifer Adipozyten und eine zunehmende Proliferationskapazität weisen auf die Förderung der Adipozyten-Dedifferenzierung hin. Die Aktorfolie aus Polymer mit Formgedächtnis ist ein aktives Biomaterial, das mit einfacher Temperaturkontrolle mechanische Spannungen erzeugen kann. Dieser künstliche Muskel ermöglicht es, den kombinierten Einfluss mehrerer physikalischer Signale auf Stammzellen zu untersuchen. Wir fanden die kombinatorischen Effekte des Zusammenspiels von mechanischen und Temperatur-Stimuli auf das MSC-Verhalten und die Veränderung der Abstammungslinie anstelle des typischen Einzeleffekts auf MSCs. Wir haben auch die Adipozyten-Dedifferenzierung mit periodischen Temperaturänderungen etabliert, die verwendet werden könnte, um alternative Stammzellquellen zu generieren und die MSC-basierte Zelltherapie in der regenerativen Medizin zu verbessern.
