Background: Catheter-related blood stream infections and sepsis due to bacterial biofilms are a major cause of morbidity and mortality in intensive care unit patients and cancer patients with long-term use of central venous catheters (CVCs). Bacterial biofilms are complex aggregates of bacteria embedded within a layer of extracellular polymeric substances making them harder to combat using standard antibiotic regimens. Microbiological culture method of colony forming units (CFUs) is routinely used towards the examination of catheter-associated bacterial infections. However, culture of catheter-tips on agar plates fails to provide information on the location and activity of viable but non-culturable cells (VBNCs), warranting the need for a complimentary diagnostic method.
Objectives: The aim of this proof of concept study was to evaluate the use of 16S rRNA directed fluorescence in situ hybridization (FISH) in combination with digital image analysis to visualize, localize and quantify the effect of the two antibiotics daptomycin and vancomycin on Staphylococcus epidermidis biofilms on central venous catheters. The FISH results were compared to those obtained using the standard culture method of counting CFUs.
Methods: S. epidermidis biofilms were grown using an in vitro model of CVC infection followed by antibiotic treatment. Subsequently, biofilm area and the fraction of metabolically active cells was investigated using FISH and microscopy in combination with digital image analysis. FISH data was compared to the standard method of diagnosis of catheter infections namely CFU data. Anti-biofilm activity of medically important antimicrobial compounds daptomycin and vancomycin was compared to phosphate buffered saline controls.
Results: The in vitro model produced S. epidermidis biofilms on polyurethane catheters and FISH was applied successfully to measure the effect of the antibiotics on the biofilms by digital image analysis. Both daptomycin and vancomycin were able to significantly reduce the area and the FISH-positive fraction of the biofilms. Daptomycin showed a more pronounced anti-biofilm activity in comparison to vancomycin.
Conclusions: This is the first study of its kind to employ FISH in combination with digital image analysis to measure anti-biofilm activity on catheters colonized by S. epidermidis biofilms. The results of this proof of concept study strongly support the use of FISH as an important complementary tool to obtain crucial information on the location and activity of bacterial cells within biofilms, not provided by CFU data. The insights provided by FISH are a valuable contribution towards the timely and successful management of bacterial-biofilm infections on catheters.
Hintergrund: Katheterassoziierte Blutstrominfektionen und Sepsis durch bakterielle Biofilme sind eine Hauptursache für Morbidität und Mortalität bei Patienten auf Intensivstationen und bei Krebspatienten mit Langzeitanwendung von Zentralvenenkathetern. Bakterielle Biofilme sind Aggregate von Bakterien, die in einer Schicht aus extrazellulären Polymer-Substanzen eingebettet sind, wodurch ihre Bekämpfung mit Standard-Antibiotika-Schemata erschwert wird. Die mikrobiologische Kulturmethode der koloniebildenden Einheiten (KBE) wird routinemäßig zur Untersuchung von katheterassoziierten bakteriellen Infektionen eingesetzt. Die Kultur von Katheterspitzen auf Agarplatten liefert jedoch keine Informationen über den Ort und die Aktivität von lebensfähigen, aber nicht kultivierbaren Zellen (VBNC), so dass eine komplementäre Nachweismethode empfehlenswert ist. Zielsetzung: Ziel dieser Arbeit war die Erstellung eines ‚Proof of Concept‘ für die Evaluation der 16S-rRNA-gerichteten Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) in Kombination mit digitaler Bildanalyse zur Visualisierung, Lokalisierung und Quantifizierung der Wirkung zweier Antibiotika (Daptomycin und Vancomycin) auf Staphylococcus epidermidis-Biofilme auf Zentralvenenkathetern. Darüber hinaus wurden die durch FISH gewonnenen Ergebnisse mit denen der KBE Standarddiagnosemethode verglichen. Methodik: S. epidermidis-Biofilme wurden unter Verwendung eines in vitro-Modells einer katheterassoziierten Infektion gezüchtet und nachfolgend einer Antibiotikabehandlung unterzogen. Anschließend wurde die Biofilmfläche und der Anteil aktiver Zellen unter Verwendung von FISH in Kombination mit Mikroskopie und digitaler Bildanalyse untersucht. Die FISH-Daten wurden mit den Daten der KBE, der Standarddiagnosemethode für katheterassoziierte Infektionen, verglichen. Die Anti- Biofilm-Aktivität von Daptomycin und Vancomycin wurde mit einer Kontrollgruppe Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung verglichen. Ergebnisse: S. epidermidis-Biofilme wurden in vitro auf Polyurethankathetern hergestellt und FISH erfolgreich angewendet, um die Wirkung der Antibiotika auf Biofilme zu messen. Sowohl Daptomycin als auch Vancomycin konnten die Biofilm-Parameter Fläche und FISH-positiver Anteil signifikant reduzieren. Daptomycin zeigte im Vergleich zu Vancomycin eine stärkere Anti-Biofilm-Aktivität. Schlussfolgerungen: Die durchgeführte Forschungsarbeit ist die erste Studie ihrer Art, bei der FISH als Analysemethode für die Anti-Biofilm-Aktivität von Antibiotika auf S. epidermidis-Biofilmen auf Kathetern verwendet wurde. Die Ergebnisse dieser ‚Proof of Concept‘ Studie unterstützen nachdrücklich die Verwendung von FISH als zusätzliches Analyseinstrument, um wichtige Informationen über den Ort und die Aktivität von Bakterienzellen in Biofilmen zu erhalten, die nicht durch KBE-Daten bereitgestellt werden können. Die Erkenntnisse dieser FISH-Studie sind ein wertvoller Beitrag zur rechtzeitigen und erfolgreichen Behandlung von bakteriellen Biofilminfektionen auf Kathetern.
