Successful treatment of infectious diseases is increasingly challenging, as emergence and spread of bacterial adaptation and resistance mechanisms threaten the availability of efficacious treatment options. A prerequisite for bacterial eradication and prevention of adaptation and resistance is sufficient antibiotic exposure at target site, which can be obtained by dosing optimisation. For that purpose, a comprehensive understanding of the relationship between pharmacokinetics (PK) and pharmacodynamics (PD), i.e., between antibiotic exposure and effect, is crucial. Currently applied PK/PD parameters and target values are mainly based on the minimal inhibitory concentration (MIC). The informative value of this endpoint measurement is limited, but appropriate alternatives are currently lacking. A comprehensive understanding of exposure-effect relationships requires knowledge about relevant antibiotic resistance and bacterial adaptation mechanisms, which has substantially increased in the last years. However, a link between PK/PD relationships and the underlying mechanisms has not been established yet. Hence, the present thesis aimed to characterise, quantify, and mechanistically explain bacterial growth-kill behaviour over time. The model compound levofloxacin (LEV) and the bacterial species Escherichia coli (E. coli) were chosen for the case study, as life-threatening infections with fluoroquinolone resistant E. coli strains are of clinically relevant concern. To characterise growth, kill and regrowth behaviour of three LEV resistant clinical E. coli isolates under LEV exposure, time-kill curve investigations in static and dynamic in vitro infection models (IVIM) were performed. Mimicking clinically relevant LEV concentration-time (C(t)) profiles, resulting from a 750 mg, 90 min LEV i.v. infusion in plasma, demonstrated the inefficacy of this approved dosing regimen against resistant strains. Bacterial regrowth was observed within 24 h for all strains, but the extent of initial reduction of bacterial concentrations and regrowth differed, even for two strains sharing the same MIC value (8 mg/L). To understand the genomic background of the observed growth-kill behaviour, a PCR and electrophoresis method was established and mutations in fluoroquinolone resistance determining regions of the isolates were identified by Sanger sequencing. Additionally, whole genome sequencing was performed by collaboration partners, and the sequence types (ST) were determined (ST58, ST88 and ST167). Widespread mutations in gyrA and parC were identified for all strains. Furthermore, ST88 harboured qnr plasmids. The higher LEV susceptibility of ST88 (MIC: 2 mg/L) compared to ST167 (MIC: 8 mg/L) was partly explained by genomic resistance mechanisms, but the reduced susceptibility of ST58 (MIC: 8 mg/L) was not solely explained by the single gyrA mutation of the isolate. To elucidate the contribution of persister formation as a phenotypic adaptation mechanism to the observed growth, kill and regrowth behaviour, an electronic cell counting assay was developed and successfully applied. Filamentation, measured as increased bacterial cell size, was used as surrogate for persister formation. Assessment of the dynamic changes in bacterial size distributions under static LEV exposure over time implied extensive persister formation of ST88 and ST167, and a comparably small extent of persister formation of ST58. To quantitatively describe the exposure-effect relationship of LEV against E. coli in static and dynamic IVIM experiments, novel PK/PD metrics were introduced, considering the full LEV C(t) profile and bacterial time-kill trajectory: (i) LEV exposure was determined as cumulative area under the LEV C(t) curve, and (ii) the antibiotic effect over time was quantified as cumulative area between the bacterial growth control curve and the time-kill curve, normalised to the area under the growth control curve. Applying these metrics, the exposure-effect relationship was described by a sigmoidal maximum effect (Emax) model, combined with an inhibition term. Based on this novel approach, precise parameter estimates for the derived PK/PD parameters, the cumulative area under the LEV C(t) profile causing 50% of the maximum effect (cumAUC50) and the cumulative area under the LEV C(t) profile causing regrowth (cumAUCreg), were obtained, discriminating the exposure-effect relationship of the strains under static and dynamic LEV exposure. Finally, gained knowledge about the strain-specific growth-kill behaviour and the underlying adaptation and resistance mechanisms was amalgamated in a three-bacterial-state PK/PD model. Leveraging two bacterial quantification methods, i.e. plate counting and electronic cell counting, allowed discrimination of three bacterial subpopulations: viable, dead and persister cells. Two manifestations of the LEV effect were identified: (i) a LEV concentration-dependent killing effect, decreasing bacterial numbers of viable cells via a sigmoidal Emax model, and (ii) an additive increase of the first-order persister formation rate constant, increasing transformation of viable cells into persister cells in presence of LEV. Different LEV potencies of the strains were quantified as strain-specific EC50 values, being 5.5-fold higher for ST58 compared to ST88, and 2-fold higher compared to ST167. The largest extent of persister formation for ST88 was confirmed by the highest increase in the persister formation rate constant under LEV exposure for the isolate. In future, application of electronic cell counting in dynamic IVIM experiments will support refinement of the PK/PD model, as the newly established method was solely applied in static IVIM experiments so far. Further, assessment of PK resistance mechanisms, such as increased expression of efflux pumps or alterations of the outer membrane, decreasing intra-bacterial LEV concentrations, might elucidate the reduced LEV susceptibility of ST58. Overall, the present thesis highlighted the limitations of the MIC value to guide antibiotic therapy and suggested novel PK/PD parameters. Bacterial adaptation and resistance were quantitatively and mechanistically characterised. The developed PK/PD model elucidated the interplay between different processes determining bacterial growth, kill and regrowth behaviour and facilitates in silico simulation of further scenarios, such as alternative LEV dosing regimens, to ultimately support rational antibiotic dosing and prevent emergence of bacterial adaptation and resistance.
Die erfolgreiche Therapie von Infektionserkrankungen stellt eine zunehmende Herausforderung dar, da die Entstehung und Verbreitung von Antibiotikaresistenz die Verfügbarkeit wirksamer Therapiemöglichkeiten bedroht. Eine Voraussetzung, um Bakterien vollständig abzutöten sowie ihre Anpassung und die Entstehung von Resistenzen zu verhindern, ist eine ausreichende Antibiotikaexposition am Wirkort, die durch optimierte Dosierung erreicht werden kann. Hierzu ist ein umfassendes Verständnis der Beziehung zwischen Pharmakokinetik (PK) und Pharmakodynamik (PD) unerlässlich, also zwischen Antibiotikaexposition und antibiotischem Effekt. Die zurzeit eingesetzten PK/PD-Parameter und ihre Zielwerte basieren überwiegend auf der minimalen Hemmkonzentration (MHK). Die MHK ist als Endpunkt-Messgröße von begrenzter Aussagekraft, jedoch fehlen derzeit angemessene Alternativen. Um Expositions-Effekt-Beziehungen von Antibiotika umfassend zu verstehen, ist die Kenntnis der relevanten Resistenz- und Anpassungsmechanismen der Bakterien essenziell. Obwohl diese in den letzten Jahren bedeutend zugenommen hat, ist der Zusammenhang zwischen PK/PD-Beziehungen und ihren mechanistischen Ursachen bisher wenig erforscht. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war daher, das zeitabhängige bakterielle Wachtsums- und Absterbeverhalten zu charakterisieren, zu quantifizieren und mechanistisch zu erklären. Das Antibiotikum Levofloxacin (LEV) und die bakterielle Spezies Escherichia coli (E. coli) wurden beispielhaft für diese Fallstudie ausgewählt, da lebensbedrohliche Infektionen mit E. coli-Stämmen mit Fluorchinolon-Resistenz von klinisch relevantem Interesse sind. Um das bakterielle Wachstum, Absterben und Wiederanwachsen drei LEV-resistenter klinischer E. coli-Isolate unter LEV-Exposition zu charakterisieren, wurden Untersuchungen in statischen und dynamischen In-vitro-Infektionsmodellen (IVIM) durchgeführt. Die Nachahmung klinisch relevanter Konzentrations-Zeitprofile (C(t)-Profile), die nach der Gabe einer 750 mg, 90 min LEV-Infusion im Plasma bestimmt werden, zeigte die Unwirksamkeit dieses zugelassenen Dosierungsschemas bei Infektionen mit resistenten Stämmen. Ein erneutes Anwachsen der Bakterienpopulationen wurde innerhalb von 24 h bei allen Stämmen beobachtet, jedoch mit einem unterschiedlichen Ausmaß des anfänglichen Absterbens und des späteren Wiederanwachsens, selbst für zwei Stämme mit derselben MHK (8 mg/L). Um die genomischen Ursachen des beobachteten Absterbeverhaltens zu verstehen, wurde eine PCR- und Gelelektrophoresemethode etabliert und wurden Mutationen der Fluorchinolon-Resistenz bestimmenden Regionen der untersuchten Isolate mittels Sequenzierung nach Sanger identifiziert. Zusätzlich wurde das Gesamtgenom der Isolate durch Kooperationspartner sequenziert, und die Sequenztypen (ST) wurden bestimmt (ST58, ST88 und ST167). In allen Isolaten ließen sich weit verbreitete Mutationen der Gene gyrA und parC festellen. In einem Isolat (ST88) wurden zusätzlich qnr-Plasmide identifiziert. Die höhere LEV-Empfindlichkeit von ST88 (MHK: 2 mg/L) im Vergleich zu ST167 (MHK: 8 mg/L) war teilweise durch genomische Resistenzmechanismen erklärbar, aber die verminderte Empfindlichkeit von ST58 (MHK: 8 mg/L) konnte nicht ausschließlich durch die einzelne gyrA-Mutation des Isolates erklärt werden. Um den Beitrag der Persisterbildung als phänotypischem Adaptationsmechanismus zum beobachteten Wachstums- und Absterbeverhalten aufzuklären, wurde ein Verfahren zur elektronischen Zellzählung entwickelt und erfolgreich eingesetzt. Filamentierung wurde durch Messung der Zellgrößen unter Exposition statischer LEV-Konzentrationen bestimmt und als Surrogat für die Persisterbildung genutzt. Die Untersuchung der dynamischen Änderung der Zellgrößenverteilung von Bakterien, die statischen LEV-Konzentrationen exponiert waren, in Abhängigkeit von der Zeit, deutete auf ausgeprägte Persisterbildung von ST88 und ST167 hin, während ST58 vergleichsweise weniger Persister bildete. Um die Expositions-Effekt-Beziehung von E. coli-Bakterien, die im IVIM statischen und dynamischen LEV-Konzentrationen exponiert waren, quantitativ zu beschreiben, wurden neuartige PK/PD-Messgrößen eingeführt, die das das gesamte LEV C(t)-Profil sowie die gesamte bakterielle Abtötungskurve berücksichtigten: (i) Die LEV-Exposition wurde als kumulierte Fläche unter der LEV C(t)-Kurve berechnet, und (ii) der antibiotische Effekt in Abhängigkeit von der Zeit wurde als kumulierte Fläche zwischen der bakteriellen Wachstumskurve und der Abtötungskurve berechnet und auf die kumulierte Fläche unter der Wachstumskurve normalisiert. Durch die Anwendung dieser Messgrößen konnte die Expositions-Effekt-Beziehung als sigmoidales Emax-Modell beschrieben werden, das mit einem Inhibitionsterm kombiniert wurde. Dieser neuartige Ansatz erlaubte die präzise Schätzung der abgeleiteten PK/PD-Parameter, der kumulierten Fläche unter der LEV C(t)-Kurve, die 50% des maximalen Effektes veruracht (cumAUC50), und und der kumulierten Fläche unter der LEV C(t)-Kurve, bei der ein Wiederanwachsen der Bakterienpopulation zu beobachten ist (cumAUCreg), mit denen die Expositions-Effekt-Beziehung der Stämme unter statischer und dynamischer LEV-Exposition unterschieden werden konnte. Schließlich ermöglichten die gewonnenen Erkenntnisse über das spezifische Wachstums- und Absterbeverhalten der Stämme und der zu Grunde liegenden Adaptations- und Resistenzmechanismen die Entwicklung eines das bakterielle Wachstums- und Absterbeverhalten charakterisierenden PK/PD-Modells. Durch die zwei eingesetzten Methoden zur Bakterienquantifizierung, zum einen Lebendkeimzahlbestimmung und zum anderen elektronische Zellzählung, konnten drei bakterielle Subpopulationen identifiziert werden: teilungsfähige Zellen, tote Zellen und Persister. Zwei Ausprägungen des LEV-Effektes waren unterscheidbar: (i) ein LEV- konzentrationsabhängiger Abtötungseffekt, der die Anzahl teilungsfähiger Bakterien im Sinne eines sigmoidalen Emax-Modells reduzierte, und eine additive Erhöhung der Persisterbildungs-Geschwindigkeitskonstante erster Ordnung unter LEV-Exposition, die die Transformation teilungsfähiger Zellen in Persisterzellen unter LEV-Einfluss förderte. Unterschiedliche LEV-Wirkstärken wurden durch spezifische EC50-Werte der drei Isolate quantifiziert. Dieser Wert war für ST58 5.5-fach höher als für ST88 und 2-fach höher als für ST167. Das größte Ausmaß der Persisterbildung durch ST88 wurde durch den größten Anstieg der Persisterbildungs-Geschwindigkeitskonstante unter LEV-Einfluss für das Isolat bestätigt. In Zukunft wird die Anwendung des elektronischen Zellzählungsverfahrens auch in dynamischen IVIM-Experimenten eine Weiterentwicklung des PK/PD-Modelles unterstützen, da die neu entwickelte Methode bisher nur in statischen Experimenten eingesetzt wurde. Weiterhin kann die Untersuchung pharmakokinetischer Resistenzmechanismen wie der gesteigerten Exprimierung von Effluxpumpen und Veränderungen der äußeren Membran, die zu verminderten intrazellulären Antibiotikakonzentrationen führen, zum Verständnis der reduzierten LEV-Empfindlichkeit von ST58 beitragen. Insgesamt hat die vorliegende Arbeit die Grenzen der MHK als Richtschnur bei der Antibiotikatherapie verdeutlicht und neue PK/PD-Parameter vorgeschlagen. Bakterielle Resistenz- und Anpassungsmechanismen wurden quantitativ und mechanistisch charakterisiert. Das entwickelte PK/PD-Modell klärte das komplexe Zusammenspiel verschiedener Prozesse auf, die das bakterielle Wachstums-, Absterbe- und Wiederanwachsverhalten bestimmten. Es ermöglicht die in silico Simulation weiterer Szenarien, wie zum Beispiel alternativer LEV-Dosierungsschemata, um letztendlich die rationale Antibiotikadosierung zu unterstützen und somit zur Verhinderung des Auftretens bakterieller Anpassungs- und Resistenzmechanismen beizutragen.
