Entomologische und molekulargenetische Untersuchungen zur Gnitzenfauna (Diptera: Ceratopogonidae) in Deutschland

Abstract

Aufgrund schwerer Ausbrüche der Blauzungenkrankheit in den Jahren 2006/2007 in Deutschland in Abwesenheit des afrikanischen Hauptvektors Culicoides imicola wurden heimische Gnitzenarten als mögliche Vektoren des Blauzungenvirus diskutiert. Da es bisher nur wenige und zudem standortbasierte Studien zur Gnitzenfauna Deutschlands gab, wurde ein bundesweites entomologisches Monitoring-Projekt ins Leben gerufen. Dafür wurden an 89 Standorten, welche sich innerhalb der Restriktionszone des Hauptausbruchsgebietes der Blauzungenkrankheit im Jahr 2006 befanden, Milchbetriebe ausgewählt, auf denen je eine Falle zum Fang der Zielinsekten und eine Wetterstation zur Erfassung verschiedener Klimadaten installiert wurde. Die Auswertung der Fänge erfolgte über den Zeitraum von März 2006 bis Mai 2007 und bestand aus der Ermittlung der Fangzahlen, des Geschlechtsverhältnisses der Gnitzen, ihrer artspezifischen Gruppenzugehörigkeit (Obsoletus-, Pulicaris-Gruppe, restliche Arten) sowie ihres Ernährungszustandes hinsichtlich einer erfolgten Blutmahlzeit. Darüber hinaus wurde von einem Teil der Proben in Zusammenarbeit mit externen Instituten die genaue Spezies bestimmt, sowie von einem weiteren Teil gesogener Gnitzen das Vorhandensein von BTV-8-Genom getestet. Im Zuge des Monitorings konnte die Abwesenheit des afrikanischen Hauptvektors C. imicola auf dem Gebiet des Seuchenausbruchs 2006/2007 bestätigt werden. Gnitzen der Obsoletus-Gruppe gehörten zu den häufigsten Gnitzenarten, gefolgt von Gnitzen der Pulicaris-Gruppe. BTV-8-Genom konnte v.a. in Gnitzen der Obsoletus-Gruppe, aber auch in Gnitzen der Pulicaris-Gruppe nachgewiesen werden, womit sich deren Vektorkompetenz bestätigte. Da auch in den Wintermonaten noch viele Gnitzen gefangen wurden, kann eine „vektor-freie Zeit“ nicht mehr festgelegt werden. Die Frage nach der exakten Speziesbestimmung der gefangenen Gnitzen machte es notwendig, eine möglichst schnelle und einfach zu handhabende Methode zu entwickeln, um heimische Culicoides-Gnitzen sicher identifizieren zu können. Da die morphologische Differenzierung zeitraubend ist und spezielle Fachkenntnisse zur Präparation und morphologischen Identifizierung erfordert, bot sich die Entwicklung eines PCR-gestützten Verfahrens mit speziesspezifischen Primern zur Identifizierung von Gnitzenarten an. Die ribosomale DNS-Region des Internal Transcribed Spacer 1 (ITS1) wurde zur Bestimmung speziesspezifischer Primer ausgewählt. Für die Entwicklung der Primer wurde DNS von Gnitzen der Arten Culicoides obsoletus s.s., C. dewulfi, C. scoticus, C. chiopterus, C. punctatus und C. pulicaris verwendet, welche im Rahmen des entomologischen Monitorings von März 2007 – Mai 2008, gefangen wurden. Zur Festlegung des Gold- Standards wurden Teile (Flügel, Kopf und Abdomen mit Geschlechtsorganen) der verwendeten Gnitzen präpariert und zur morphologischen Identifizierung auf Objektträgern fixiert. Nach Extraktion der DNS aus den verbleibenden Körperteilen (Thorax mit Beinen und oberem Abdomen) und Amplifikation der ITS1-Region mit den gattungsspezifischen Primern PanCulF/PanCulR (Cêtre-Sossah et al., 2004), erfolgte die Ermittlung potenzieller Vorwärts- Primerregionen für jede der Zielspezies mittels spezieller Software; als Rückwärtsprimer diente der rückwärtige Primer PanCulR aus dem gattungsspezifischen Primerpaar. Die Eignung der ermittelten Primer wurde softwaregestützt getestet und die Synthese der Primer CulObsF2, CulDewF, CulChioF, CulPunctF und CulPulF daraufhin bei einem Speziallabor veranlasst. Für jeden dieser Primer wurde das ideale PCR-Protokoll (teilweise touchdown- Protokoll) durch Bestimmung der optimalen MgCl2-Konzentration und Annealing- Temperatur ermittelt. Die entwickelten Primer wurden in verschiedenen Verfahren auf ihre analytische Spezifität und Sensitivität hin getestet. Der Einsatz der Primer wurde mittels verschiedener Untersuchungen getestet. Verbesserungsvorschläge für zukünftige entomologische Untersuchungen und der Einsatz der speziesspezifischen Primer bei künftigen Studien wurden diskutiert.

Due to the severe outbreaks of bluetongue disease in the years 2006/2007 in Germany in the absence of the main African vector Culicoides imicola, the role of authochtonous midges as possible vectors of the bluetongue disease were discussed. Only few local studies regarding the midge fauna of Germany existed therefore an entomological monitoring project covering a great part of Germany was launched. At 89 dairy farms located within the restriction zone of the bluetongue epidemic of 2006 UV-light traps for catching target insects as well as weather stations for collecting climate data were installed. The catches were performed during March 2006 and May 2007 and were analysed regarding the numbers of caught midges, their sex ratio, their belonging to the C. obsoletus group, C. pulicaris group or other, as well as their status of blood engorgement. Furthermore, a certain number of midges were analysed down to species level as well as tested for BTV-8 genome by cooperating institutes. The results of the monitoring project confirmed the abscence of the main vector C. imicola in the region of the epidemic of 2006/2007. Midges of the C. obsoletus group were caught most numerous, followed by midges of the C. pulicaris group. BTV-8 genome was mostly found in midges of the C. obsoletus group but also in some of the C. pulicaris group affirming their vector potential. Because midges were still caught in the months of winter a “vector- free period” could not be defined. In order to identify caught midges down to species level, a rapid and easy applicable method for identification of autochthonous Culicoides spp. had to be developed. Since morphological differentiation is time-consuming and demands specialised knowledge of preparation and identification, a polymerase chain reaction (PCR)-based procedure in connection with species-specific primers provided a solution. The region of internal transcribed spacer 1 (ITS1) of the ribosomal DNA was chosen as target sequence for the development of speciesspecific primers. The DNA used for the development of primers originated from Culicoides obsoletus s.s., C. dewulfi, C. scoticus, C. chiopterus, C. punctatus and C. pulicaris midges captured during the entomological monitoring of March/April 2007 – May 2008. In order to determine a gold standard body parts of the chosen midges (wings, head, abdomen with genitals) were mounted on slides for morphological identification. The DNA was extracted from the remaining parts (thorax with legs and upper abdomen) and the ITS1-region amplified using the conservative primers PanCulF/PanCulR (Cêtre-Sossah et al., 2004). Potential forward-primer regions were determined with the help of DNA-software; PanCulR was kept as reverse primer. The qualification of the potential primers was tested using DNAsoftware and the synthezisation of the primers CulObsF2, CulDewF, CulChioF, CulPunctF and CulPulF was carried out by a spezialised laboratory. For each primer an optimized PCR protocol was developed by determining the ideal MgCl2 concentration and annealing temperatur; for some primers a touchdown method was applied. Using different procedures the primers’s analytical specificity and sensitivity was defined. The deployment of the primers was tested through different methods. Suggestions of improvement for subsequent entomological investigations were mentioned and the utilization of species-specific primers in future studies discussed.