Tapasin, the central component of the peptide loading complex (PLC), acts as the peptide editor to shape the peptide pool presented by MHC-I on the cell surface for immune recognition. The previously published Cryo-EM structure of the PLC provides insight into how tapasin interacts with MHC-I as well as other PLC components. However, the molecular mechanism of tapasin-mediated peptide exchange of MHC-I remains elusive, given the inherent dynamics of critical regions within the complex. Here, dynamic changes of MHC-I in the presence of tapasin as detected by NMR spectroscopy were investigated and conformational dynamics affected by tapasin binding were observed in two regions of the MHC-I molecule. Based on that, I propose tapasin exploiting two essential structural features of MHC-I: First, tapasin samples a conserved allosteric site underneath the α2-1-helix of MHC I, “loosening” the F-pocket region that binds with the C-terminus of the peptide. Second, tapasin scoop loop11-20 transiently samples the F-pocket, enabling competitive peptide binding. By investigating the role of individual residues of the loop11-20 for tapasin-catalyzed peptide exchange in vitro, tapasin residues L18 and K16 was defined to be critical for tapasin’s allele-specific activity. Furthermore, I compared dynamic profiles of four human MHC-I allotypes and their susceptibilities to tapasin-mediated or TAPBPR-mediated peptide exchange. The inverse dependence of a particular allotype on these two editors was observed, which suggested that tapasin and TAPBPR apply different recognition models. By comparing residues affected upon tapasin or TAPBPR binding, differently affected residues of MHC-I were identified. Based on that, it can be proposed that tapasin turns MHC-I into an “unlocked” conformation after binding to MHC-I instead of recognizing a minor state, a mechanism applied by TAPBPR. The study here provides a comprehensive comparison between tapasin and TAPBPR. Moreover, I observed that the composition of the functional loop11-20 matched well with the F-pocket nature of MHC-I allotypes of different species. The mechanistic findings unravel the co-evolution of the composition of the tapasin scoop loop and the F-pocket composition of mammalian MHC-I allotypes. Thus, regions of evolutionary conservation and allelic diversification cooperate to provide structurally malleable elements in MHC-I molecules tailored towards tapasin editing and the presentation of a broadened antigenic repertoire. Lastly, we obtained the cryo-EM structure of the MHC-I-ERp57-Tsn complex by introducing cysteine mutations on β2m and Tsn for disulfide linkage. We observed that the peptide exchange rate was enhanced dramatically when using the disulfide-linked complex to perform peptide exchange assays for some allotypes (such as A*03:01 and A*02:01) but not for B*27:09. We revealed the difference in enhancement of peptide exchange was due to the chaperone function of tapasin. Thus, we provided the in vitro experimental evidence to show tapasin’s dual function: catalyzing peptide exchange and stabilizing the empty MHC-I. We propose the feasibility to use the disulfide bond constructs for cell surface peptide exchange experiments in vitro, showing the potential in application of building cell libraries for characterizing antigen-specific TCR repertoires and identifying immunodominant clones.
Tapasin, die zentrale Komponente des Peptid-Beladungs-Komplex (PLC), fungiert als Peptid-Editor, um den Peptidpool zu modulieren, der von MHC-I auf der Zelloberfläche zur Immunerkennung präsentiert wird. Die aktuell veröffentlichte Cryo-EM-Struktur des PLC gibt Aufschluss darüber, wie Tapasin mit MHC-I sowie anderen PLC-Komponenten interagiert. Der molekulare Mechanismus des Tapasin-vermittelten Peptidaustauschs von MHC-I bleibt jedoch aufgrund der inhärenten Dynamik der kritischen Regionen innerhalb des Komplexes schwer zu verstehen. Hier Hier habe ich die dynamischen Veränderungen von MHC-I in Gegenwart von Tapasin mittles NMR-Spektroskopie untersucht und konnte Konformationsdynamiken beobachten, die durch die Tapasin-Bindung in zwei Regionen des MHC-I-Moleküls beeinflusst werden. Die Ergebnisse zeigen, dass Tapasin zwei wesentliche strukturelle Merkmale von MHC¬ I ausnutzt: Erstens tastet Tapasin eine konservierte allosterische Stelle unterhalb der α2-1-Helix von MHC-I ab und "lockert" so die F-Taschenregion, die den C-Terminus des Peptids beherbergt. Zweitens bindet die Schaufel-artige Schleife11-20 von Tapasin vorübergehend die F-Tasche, was eine kompetitive Peptidbindung ermöglicht. Wir untersuchten im Detail die Rolle einzelner Reste der Schleife11-20 für den Tapasin-katalysierten Peptidaustausch in vitro und zeigten die kritische Rolle der Tapasin-Reste L18 und K16 für Tapasins Allel-spezifische Katalyse-Aktivität. Darüber hinaus habe ich die dynamischen Profile von vier humanen MHC-I-Allotypen und deren Empfindlichkeit für den Tapasin- oder TAPBPR-vermittelten Peptidaustauschs verglichen. Es zeigte sich eine entgegengesetzte Abhängigkeit eines bestimmten Allotyps von den beiden Peptid-Editoren was nahe legt, dass Tapasin und TAPBPR durch unterschiedliche Erkennungsmodelle beschrieben werden können. Der Vergleich der die Reste von MHC-I, die bei der Bindung von Tapasin oder TAPBPR eine Rolle spielen, zeigte, dass unterschiedliche Reste betroffene sind. Das impliziert, dass Tapasin nach der Bindung eine "entriegelte" Konformation in MHC-I induziert, anstatt einen seltenen konformationellen Zustand zu erkennen, ein Mechanismus, der von TAPBPR angewendet wird. Meine Arbeit liefert einen umfassenden Vergleich zwischen Tapasin und TAPBPR. Darüber hinaus konnt ich beobachten, dass die Zusammensetzung der Schleife11-20 gut mit den F-Taschen-Eigenschaften von MHC-I-Allotypen in verschiedenen Spezies korreliert. Unsere mechanistischen Erkenntnisse entschlüsseln die Co-Evolution der Zusammensetzung der Tapasin-Funktionsschleife und der F-Pocket-Zusammensetzung der MHC-I-Allotypen von Säugetieren. Somit kooperieren Regionen evolutionärer Konservierung und allelischer Diversifizierung, um strukturell formbare Elemente in MHC-I-Molekülen bereitzustellen, die auf die Tapasin-Editierung und die Präsentation eines erweiterten Antigen-Repertoires zugeschnitten sind. Schließlich erhielten wir die Cryo-EM-Struktur des MHC-I-ERp57-Tsn-Komplexes durch Einführung von Cystein-Mutationen auf β2m und Tsn für die Disulfid-Bindung. Wir beobachteten, dass die Peptidaustauschrate bei der Verwendung des disulfidverknüpften Komplexes zur Durchführung von Peptidaustauschassays für einige Allotypen (z. B. A*03:01 und A*02:01) drastisch erhöht war, nicht aber für B*27:09. Wir konnten zeigen, dass der Unterschied in der Erhöhung der Peptidaustauschrate auf die Chaperonfunktion von Tapasin zurückzuführen ist. Damit lieferten wir den experimentellen in vitro Beweis für die Doppelfunktion von Tapasin: Katalysierung des Peptidaustauschs und Stabilisierung des MHC-I im Peptid ungebundenen Zustand. Außerdem haben wir das Konzept des Peptidaustauschs auf der Zelloberfläche unter Verwendung der Disulfid verknüpften Konstrukte dargerlegt, welches Anwendungspotenzial für den Aufbau von Zellbibliotheken zur Charakterisierung von Antigen-spezifischen TCR-Repertoires und zur Identifizierung von immundominanten T-Klonen bietet.
