Analysis of the 17β-Estradiol-dependent Periostin regulation in human cardiac fibroblasts
Background: Cardiac fibrosis contributes to heart failure progression. Men with aortic stenosis (AS) exhibit more fibrosis and significant higher Periostin (POSTN) protein levels than women. In addition, only male AS-patients show significant induction of POSTN mRNA compared to healthy controls. Moreover, it is known that 17β-Estradiol (E2) and estrogen receptors (ER) contribute to sex differences in cardiac fibrosis in mice. Analysis of cardiac fibroblasts from rodents and humans indicate the direct regulation of cardiac fibrosis-associated genes by E2 and ER. So far, there are no data available whether E2 and ER regulate POSTN in human cardiac fibroblasts (hCF). Therefore, we aimed to unravel the effects of E2 and ER on POSTN expression and secretion in male and female hCF. We further tested whether a possible E2-mediated POSTN regulation in hCF affects cardiomyocytes (CM).
Methods: hCF from healthy donors (n=3 per sex) were treated with E2 (10nM), ERα- (10nM PPT), ERβ-agonist (10nM ERB), or vehicle for 6h/12h/ 24h. POSTN mRNA and protein were measured in whole-cell lysates and cell culture supernatants (CCS). Induced human pluripotent stem cell-derived CM (hiPSC-CM) from both sexes were 24h incubated with CCS from hCF +/- 6h E2-treatment. NPPA, NPPB, MYH6, and MYH7 mRNA were measured as markers for CM-activation.
Results: In hCF, 12h E2-treatment down-regulated POSTN mRNA in female (p<0.05), but increased POSTN mRNA level in male cells compared to vehicle (p<0.05). 12h ER-agonist treatment showed no effect on POSTN mRNA. 6h E2-treatment increased POSTN protein in whole-cell lysate samples of both sexes (p<0.01), while secreted POSTN protein was regulated in a similar sex-specific manner as observed for mRNA level after 12h E2-treatment. CCS, derived from male and female hCF +/- E2-treatment, activated CM in a sex-specific manner. Incubation of hiPSC-CM with CCS derived from male and female hCF +/-6h E2-treatment regulated MYH6, MYH7, NPPA, and NPPB mRNA compared to control, but not in a sex-specific manner.
Conclusion: The E2-induced sex-specific regulation of POSTN mRNA and secretion in hCF is a novel mechanism, likely to contribute to sex-dependent cardiac fibrosis as observed in the clinic. Further analyses have to be carried out in order to better understand and unravel the sex-specific mechanisms leading to the sex-divergent regulation of POSTN by E2 and ER. A profound knowledge of how E2 and ER mediate sex-specific cardiac fibrosis development could help to design pharmacological interventions according to patient’s sex.
Untersuchungen zur 17β-Östradiol-abhängigen Periostin-Regulation in humanen kardialen Fibroblasten
Hintergrund: Die kardiale Fibrose trägt zur Progression einer zugrundeliegenden Herzerkrankung bis hin zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz bei. Männer mit Aortenstenose (AS) weisen im Vergleich zu Frauen eine vermehrte Fibrose und ein signifikant höheres Periostin (POSTN) Proteinniveau auf. Außerdem zeigten lediglich männliche AS-Patienten eine Induktion von POSTN mRNA im Vergleich zu gesunden Kontrollen (p<0,001). Untersuchungen am Mausmodell zeigten, dass 17β-Östradiol (E2) und Östrogenrezeptoren (ER) zu Geschlechterunterschieden in der Entstehung der kardialen Fibrose beitragen. Weitere Analysen in kardialen Fibroblasten aus Mensch und Maus weisen dabei auf eine direkte Beteiligung von E2 und den ER in der Regulation Fibrose-assoziierter Gene hin. Bisher gibt es aber keine Daten darüber, ob E2 und ER POSTN in humanen kardialen Fibroblasten (hCF) regulieren. Daher war es Ziel dieser Arbeit, die Effekte von E2 und ER auf die POSTN-Expression und -Sekretion in männlichen und weiblichen hCF zu untersuchen. Ferner haben wir analysiert, ob eine mögliche E2-vermittelte POSTN-Regulation in hCF die Kardiomyozyten (CM)-Aktivierung beeinflusst.
Methoden: Kommerziell erworbene hCF von gesunden Spender*innen (n=3 pro Geschlecht) wurden mit 10nM E2, ERα- (10nM PPT), ERβ-Agonist (10nM ERB) oder Vehikel für je 6h/12h/ 24h behandelt. POSTN mRNA und Protein wurden in Gesamtzelllysaten und Zellkulturüberständen (ZKÜ) gemessen. Humane induzierte, pluripotente Stammzell-CM (hiPSC-CM) beider Geschlechter wurden für 24h mit ZKÜ von hCF +/- 6h E2-Behandlung inkubiert. Die Messung der mRNA-Level von NPPA, NPPB, MYH6 und MYH7 dienten als Marker für eine CM-Aktivierung.
Ergebnisse: Eine 12h E2-Behandlung reprimierte die POSTN mRNA weiblicher hCF (p<0,05), aber erhöhte das POSTN mRNA-Niveau in männlichen hCF gegenüber dem Vehikel (p<0,05). Die 12-stündige ER-Agonisten-Behandlung zeigte keinen Effekt bezüglich der POSTN mRNA-Regulation. Eine 6h E2-Behandlung erhöhte das POSTN-Protein in Zelllysaten beider Geschlechter (p<0,01), während das sezernierte POSTN-Protein in einer ähnlichen geschlechtsspezifischen Weise reguliert wurde wie die mRNA nach 12h E2-Behandlung. Die Inkubation der hiPSC-CM mit dem aus männlichen und weiblichen hCF +/- 6h E2-Behandlung gewonnenem ZKÜ führte zu einer Regulation der MYH6, MYH7, NPPA und NPPB mRNA gegenüber der Kontrolle. Geschlechtsspezifische Unterschiede konnten hier nicht beobachtet werden.
Schlussfolgerungen: Die E2-induzierte, geschlechtsspezifische Regulation von POSTN in hCF ist ein neuartiger Mechanismus, der wahrscheinlich zur geschlechtsabhängigen Ausprägung einer klinisch manifesten Herzfibrose beiträgt. Weitere Analysen der E2- und ER-vermittelten geschlechtsspezifischen Regulation von POSTN sollten zum besseren Verständnis und zur detaillierten Aufklärung beitragen. Ein profundes Wissen darüber, wie E2 und ER die geschlechtsspezifische Entwicklung der Herzfibrose vermitteln, könnte helfen, pharmakologische Interventionen entsprechend dem Patient*innen-Geschlecht zu adressieren.
