Therapy of bacterial infectious diseases is an increasingly challenging task due to the emergence of resistance, which has become a major threat for global healthcare in the last years. In particular, lower respiratory tract infections are contributing extensively as the leading infectious cause of death in the world. The dynamics in the development of new bacterial resistance mechanisms highlight this alarming trend. Currently, combining at least two antibiotics is the most important and ultimo-ratio strategy to overcome an infection in patients being severely infected with highly resistant bacterial strains. However, the emergence of bacterial resistance is already restricting current approaches and illustrates the high priority of novel advanced strategies.
Hence, the pursuit of innovative treatment regimens is urgently required to address this challenge. One strategy is the use of immunostimulatory drugs in combination with antibiotics to contribute minimising both, the emergence of antibiotic resistance in pathogens and treatment failure. Targeting the innate immune response has the advantage of interacting with the host rather than the pathogen and, accordingly, being able to delay bacterial resistance development. In combination with currently available antibiotic drugs, the novel approach is rapidly accessible to support anti-infective therapy and sustain effectiveness of antibiotic drugs.
The present thesis aims to develop non-conventional combination regimens of antibiotic and immunostimulatory drugs to treat clinically most relevant bacterial species in terms of lower respiratory tract infections. The main objectives were to initially select potential drug combination partners in vitro, evaluate their preclinical exposure-response relationship in vivo, and define the efficacy of this combination regimen by applying pharmacometric approaches in silico. By amalgamating these methods, mechanistic and quantitative insights and an enhanced understanding of the applied combination were intended to ultimately allow a translation into a clinical setting.
The in vitro investigations characterised the bacterial strains Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus and Streptococcus pneumoniae and assessed the single and combined effects of the utilised antibiotic and immunostimulatory drugs by conducting conventional susceptibility and checkerboard studies. Antibacterial effects of immunostimulatory drugs could be exerted by direct, i.e. drug-mediated, or indirect, i.e. modulator-mediated, effects. For that purpose, modulator-mediated effects were assessed in a newly developed time-kill curve assay allowing growth in cell-pretreated medium. Here, drug-mediated effects were excluded, no distinct modulator-mediated effects were determined and no potential interactions in combination with antibiotics were shown.
Based on the conducted in vitro studies and state-of-the-art knowledge, the combination of the antibiotic amoxicillin and the immunostimulatory drug monophosphoryl lipid A (MPLA) was selected aiming to characterise the dynamic interplay of the drugs, the pathogen and the host in vivo in a murine pneumonia model in collaboration with project partners at the Institut Pasteur de Lille. Both drugs were investigated after administration to mice 12 h after infection with Streptococcus pneumoniae in monotherapy or a combined treatment regimen. Exploiting pharmacokinetic and pharmacodynamic data from the mouse infection model, the preclinical exposure-response relationship of this combination was characterised in an overarching pharmacometric analysis:
Quantification of orally administered amoxicillin in mouse serum was enabled by the successful development, validation and application of a rapid, simple and highly sensitive liquid chromatography tandem mass spectrometry assay leading to fully described concentration-time profile of amoxicillin. The pharmacodynamic effects of amoxicillin and MPLA were comprehensively characterised in vivo by assessing the bacterial burden at the infection site lung and the spleen as surrogate of sepsis, by survival and by different markers representing the physical condition and the immune response of the animal. In combination, the bacterial burden was substantially reduced, and survival was improved. The innate immune response was simultaneously affected by the bacterial strain as well as the immunostimulatory drug.
The developed semi-mechanistic pharmacokinetic/pharmacodynamic model provided quantitative insights on basis of the generated in vivo data. MPLA coadministration reduced the amoxicillin clearance at maximum by 40.9% for a dose of 1.2 mg/kg amoxicillin. On top of this pharmacokinetic interaction, a pharmacodynamic interaction was determined: The combined treatment was superior to both monotherapies with MPLA enhancing the efficacy of amoxicillin after 48 h by more than 50% compared to amoxicillin alone after 48 h. MPLA was able to boost the innate immune response by 1.40-fold. This effect was rather delayed and benefitted of the contrarily immediate response of amoxicillin. Combining MPLA cotreatment with amoxicillin concentrations above the minimal inhibitory concentration for >3.23 h, a survival rate of >95% was achieved with MPLA reducing the required time of amoxicillin concentrations above the minimal inhibitory concentration by 1.23 h compared to monotherapy. Additionally, survival of mice in the combined treatment approach at highest amoxicillin dose (1.2 mg/kg) was increased 1.35-fold to 90.3% after 14 d compared to monotherapy. To investigate the potential benefits of this therapeutic approach in a clinical setting, important steps towards a translation to humans were performed. Whereas adequate and plausible translation of the pharmacokinetics of amoxicillin was possible, the innate immune response was not completely characterised and, accordingly, not translatable. Still, valuable insights into interactions of bacteria, the drugs and the host were established and critical aspects hampering a translation were identified.
To conclude, applying pharmacometric approaches increased the understanding of the pathophysiology of the infection and allowed a link between pharmacokinetics and pharmacodynamics. The characterised boost of the immune system and the enhanced antibacterial efficacy clearly indicated the potential of immunostimulatory drugs to function as combination partner of antibiotic drugs to treat bacterial infections in humans in future.
Die Therapie von bakteriellen Infektionskrankheiten ist eine immer schwieriger werdende Herausforderung, da sich der deutliche Anstieg in der Entstehung von bakteriellen Resistenzen in den letzten Jahren zu einer großen Bedrohung für die globale Gesundheitsversorgung entwickelt hat. Insbesondere Infektionen der unteren Atemwege verursachen in Relation zu anderen Infektionskrankheiten den weltweit größten Anteil an Todesfällen. Die Dynamik in der Entwicklung neuer bakterieller Resistenzmechanismen verdeutlicht diesen alarmierenden Trend. Gegenwärtig ist die Kombination von mindestens zwei Antibiotika die wichtigste Strategie zur Behandlung einer Infektion bei Patienten, die mit hochresistenten Bakterien infiziert sind. Das Auftreten bakterieller Resistenzen schränkt jedoch bereits jetzt die derzeitigen Behandlungsansätze ein und verdeutlicht die hohe Priorität neuartiger fortgeschrittener Strategien.
Um dieser Herausforderung zu begegnen, ist die Verfolgung innovativer Behandlungsansätze dringend erforderlich. Eine Strategie ist der Einsatz von immunstimulierenden Arzneistoffen in Kombination mit Antibiotika, die dazu beitragen sollen, sowohl die Entstehung von Antibiotikaresistenzen als auch das Versagen der Behandlung zu minimieren. Die Stimulation der angeborenen Immunantwort hat den Vorteil, dass direkt mit dem Wirt statt vor allem mit dem Erreger interagiert wird. Dementsprechend kann die bakterielle Resistenzentwicklung verzögert werden. In Kombination mit derzeit verfügbaren Antibiotika ist dieser neuartige Ansatz vergleichsweise schnell umzusetzen, um die Therapie von Infektionskrankheiten zu unterstützen und die Wirksamkeit der antibakteriellen Arzneistoffe aufrechtzuerhalten.
Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, nichtkonventionelle Kombinationstherapien von antibiotischen und immunstimulierenden Arzneistoffen zu entwickeln, um die klinisch relevantesten Bakterien als Auslöser von Atemwegsinfektionen zu behandeln. Die Hauptziele waren zunächst die Auswahl potenzieller Arzneistoffkandidaten in vitro, die Bewertung ihrer präklinischen Expositions-Wirkungsbeziehung in vivo und die Definition der Wirksamkeit dieses Kombinationsschemas durch Anwendung pharmakometrischer Modelle in silico. Durch das Vereinigen dieser Methoden sollten mechanistische und quantitative Erkenntnisse sowie ein verbessertes Verständnis der angewandten Kombination letztendlich eine Übertragung in die klinische Praxis ermöglichen. In den In-vitro-Untersuchungen wurden die Bakterienstämme Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus und Streptococcus pneumoniae charakterisiert und die Einzel- und Kombinationswirkungen der eingesetzten antibiotischen und immunstimulierenden Arzneistoffe durch konventionelle Empfindlichkeits- und Interaktionsstudien bewertet. Die Wirkung von immunstimulierenden Arzneistoffen kann durch direkte, d.h. arzneistoffvermittelte, oder indirekte, d.h. modulatorvermittelte Effekte ausgeübt werden. Zu diesem Zweck wurden die modulatorvermittelten Wirkungen in einem neu entwickelten Assay bewertet, der das zeitabhängige Wachstums- bzw. Absterbeverhalten der Bakterien in einem modulatorenthaltendem Medium ermöglicht. Dabei wurden arzneistoffvermittelte Effekte ausgeschlossen, keine eindeutigen modulatorvermittelten Effekte festgestellt und keine potenziellen Wechselwirkungen in Kombination mit Antibiotika gezeigt.
Auf der Grundlage der durchgeführten In-vitro-Studien und den neusten Erkenntnissen aus der aktuellen Literatur wurde die Kombination des Antibiotikums Amoxicillin mit dem immunstimulierenden Arzneistoff Monophosphoryl Lipid A (MPLA) ausgewählt, um das dynamische Zusammenspiel der Arzneistoffe, des Erregers und des Wirts Maus in einem Pneumonie-Modell in Zusammenarbeit mit Partners des Institut Pasteur de Lille zu charakterisieren. Beide Arzneistoffe wurden den Mäusen einmalig 12 h nach einer Infektion mit Streptococcus pneumoniae als Monotherapie oder in einem kombinierten Therapieansatz verabreicht. Unter Nutzung pharmakokinetischer und pharmakodynamischer Kenntnisse wurde die präklinische Expositions-Wirkungs-Beziehung dieser Kombination in einer übergreifenden pharmakometrischen Analyse charakterisiert: Die Quantifizierung von oral verabreichtem Amoxicillin in Mäuseserum wurde durch die erfolgreiche Entwicklung, Validierung und Anwendung eines schnellen, einfachen und hochempfindlichen Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Assays ermöglicht, der die Erfassung eines vollständig beschriebenen Konzentrations-Zeit-Profils von Amoxicillin ermöglichte. Die pharmakodynamischen Effekte von Amoxicillin und MPLA wurden in vivo umfassend charakterisiert, indem die bakteriellen Konzentrationen an dem Ort der Infektion, der Lunge, und der Milz als Surrogat für Sepsis, das Überleben und verschiedene Marker, die die Gesundheit und die Immunantwort der Mäuse repräsentieren, bestimmt wurden. In Kombination beider Arzneistoffe wurde die bakterielle Konzentration erheblich reduziert und die Überlebensrate deutlich gesteigert. Die angeborene Immunantwort wurde gleichzeitig sowohl durch die Pathogene als auch durch den immunstimulierenden Arzneistoff beeinflusst.
Das entwickelte semi-mechanistische pharmakokinetische/pharmakodynamische Modell lieferte quantitative Erkenntnisse auf der Grundlage der generierten In-vivo-Daten. Die gleichzeitige MPLA-Gabe verringerte die Amoxicillin-Clearance in Abhängigkeit von der Amoxicillin-Dosis linear um maximal 40.9%. Zusätzlich zu dieser pharmakokinetischen Interaktion wurde eine pharmakodynamische Interaktion bestimmt: Die Kombinationstherapie war den jeweiligen beiden Monotherapien überlegen, da MPLA die Wirksamkeit von Amoxicillin nach 48 h um mehr als 50% gegenüber der alleinigen Amoxicillingabe steigerte. MPLA konnte die angeborene Immunantwort um das 1.40-Fache verstärken. Dieser Effekt trat verzögert auf und profitierte von dem im Gegensatz dazu sofortigen Effekt von Amoxicillin. Die Kombination der MPLA-Behandlung mit Amoxicillin-konzentrationen oberhalb der minimalen Hemmkonzentration für mindestens 3.23 h erreichte eine Überlebensrate von 95%. So reduzierte MPLA die benötigte Zeit von Amoxicillinkonzentration oberhalb der minimalen Hemmkonzentration um 1.23 h. Zudem konnte in der Kombinationstherapie bei einer Amoxicillindosis von 1.2 mg/kg das Überleben nach 14 Tagen im Vergleich zur Monotherapie um das 1.35-fache auf 90.3% gesteigert werden. Um den potenziellen Nutzen dieses therapeutischen Ansatzes in einem klinischen Umfeld zu untersuchen, wurden wichtige Schritte in Richtung einer Übertragung auf den Menschen unternommen. Während eine adäquate und plausible Übertragung der Pharmakokinetik von Amoxicillin möglich war, konnte die angeborene Immunantwort nicht vollständig charakterisiert werden und war dementsprechend nicht übertragbar. Dennoch konnten wertvolle Erkenntnisse über die Wechselwirkungen zwischen Bakterien, den Arzneistoffen und dem Wirt gewonnen und kritische Aspekte, die eine Übertragung behindern, identifiziert werden.
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die Anwendung pharmakometrischer Ansätze das Verständnis der Pathophysiologie der Infektion verbesserte und eine Verbindung zwischen Pharmakokinetik und Pharmakodynamik ermöglichte. Die charakterisierte Stärkung des Immunsystems und die verbesserte antibakterielle Wirksamkeit zeigten deutlich das Potenzial immunstimulierender Arzneistoffe, in Zukunft als Kombinationspartner von Antibiotika zur Behandlung bakterieller Infektionen beim Menschen zu fungieren.
